Escherichia Coli O157: H7 نیوکلک ایسڈ ڈیٹیکشن کٹ (PCR فلوروسینٹ پروب میتھڈ/Lyophilization)
کٹ کی تفصیل:
بلی نہیںایف پی 103
یہ خوراک، خوراک، پانی کے نمونوں اور ماحولیاتی نمونوں میں E. coli O157:H7 کی تیزی سے پتہ لگانے اور اسکریننگ کے لیے استعمال ہوتا ہے۔
تفصیل
کے لیے استعمال ہوتا ہے۔خوراک، خوراک، پانی کے نمونوں اور ماحولیاتی نمونوں میں E. coli O157:H7 کی تیزی سے نشاندہی اور اسکریننگ۔
[ٹیسٹنگ اصول]
فلوروسینٹ پی سی آر ٹکنالوجی کے اصول کے مطابق، مخصوص پرائمر اور تاقمان پروب ایسچریچیا کولی O157: H7 کے مخصوص جین کے لیے ڈیزائن کیے گئے ہیں، اور ایک فلوروسینٹ پی سی آر آلے کے ذریعے اس کا پتہ لگایا گیا ہے، تاکہ Escherichia coli O157: H7 کی ڈی این اے کی کوالیٹیٹو شناخت کا احساس کیا جا سکے۔
کٹ کے مشمولات
نوٹ: ROX چینل کی تحقیقات شامل نہیں ہے۔
| Cاجزاء | تفصیلات | Qاتحاد |
| بفر اے | نالی | 1 |
| بفر بی | نالی | 1 |
| مثبت کنٹرول | نالی | 1 |
| منفی کنٹرول | نالی | 1 |
متوقع استعمال
کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ خوراک، خوراک، پانی کے نمونوں اور ماحولیاتی نمونوں میں E. coli O157:H7 کی تیزی سے نشاندہی اور اسکریننگ۔
ذخیرہ کرنے کی شرائط اور میعاد ختم ہونے کی تاریخ
اندھیرے میں -20℃ پر اسٹور کریں اور بار بار جمنے اور پگھلنے سے بچیں۔
میعاد کی مدت 12 ہے۔مہینے، اور پیداوار کی تاریخ بیرونی پیکیجنگ پر دکھایا گیا ہے.
آلات اور استعمال کی اشیاء
فلوروسینٹ مقداری پی سی آر آلہ، پائپیٹ گن اور میچنگ ٹپس، ورٹیکس شیکر، منی سینٹری فیوج۔
استعمال
1. نمونہ پروسیسنگ
1.1 نمونے کی قسم: یہ کٹ خوراک، خوراک، پانی کے نمونوں اور دیگر نمونوں کے لیے موزوں ہے جن کا شبہ ہے کہ Escherichia coli O157:H7 سے آلودہ ہے۔گہرے پروسیس شدہ گوشت کی مصنوعات، مشروبات اور دیگر مادوں کے لیے جن میں روغن ہوتا ہے، فلوروسینس سگنل جمع کرنے کو متاثر کرنے سے بچنے کے لیے انہیں دھونے کی ضرورت ہوتی ہے۔
1.2 نمونے کی پروسیسنگ: نمونے کی تیاری، افزودگی کلچر اور ایسچریچیا کولی O157 کی تنہائی کے لیے "جی بی 4789.10-2016 فوڈ سیفٹی نیشنل اسٹینڈرڈ فوڈ مائکرو بائیولوجیکل ایگزامینیشن آف ایسچریچیا کولی O157: H7 ٹیسٹ" دیکھیں۔
- Nیوکلک ایسڈ نکالنا
1.5 ملی لیٹر سینٹری فیوج ٹیوب میں 20 ملی لیٹر افزودگی کا محلول لیں، 200 μL مائکروبیل لیسیٹ شامل کریں (اضافی کٹ درکار ہے)، 30 سیکنڈ کے لیے بھنور، مختصر طور پر سینٹری فیوج، اور ایک طرف رکھ دیں۔
ریمارکس: لیسیٹ سے نیوکلک ایسڈ کا اخراج 10 منٹ کے اندر مکمل ہونا چاہیے، اور اسے زیادہ دیر تک ذخیرہ نہیں کیا جا سکتا۔
3. نیوکلک ایسڈ پروردن
3.1 استعمال کے لیے فلوروسینٹ مقداری PCR آلے کو آن کریں۔
کٹ سے بفر A اور Buffer B، انہیں اچھی طرح پگھلائیں، اور مختصر طور پر سینٹری فیوج کریں۔ہر پی سی آر ری ایکشن ٹیوب میں 18 μL بفر A اور 2 μL بفر B شامل کریں۔پھر 5 ملی لیٹر ہر ایک منفی کنٹرول، نکالا ہوا نیوکلک ایسڈ، اور مثبت کنٹرول کو پی سی آر ری ایکشن ٹیوبوں میں شامل کریں، ٹیوبوں کو کیپ کریں، اور مختصر طور پر سینٹری فیوج کریں۔
3.3 پی سی آر ری ایکشن ٹیوب کو فلوروسینٹ پی سی آر مشین میں منتقل کریں، اور ایمپلیفیکیشن تجربات کرنے کے لیے درج ذیل طریقہ کار استعمال کریں: ری ایکشن سسٹم کے لیے 25 ملی لیٹر کا انتخاب کریں، ہر سائیکل کے لیے 60 °C پر فلوروسینس سگنل جمع کریں، اور پتہ لگانے کے چینل کے لیے FAM منتخب کریں۔
| قدم | پروگرام | سائیکلوں کی تعداد |
| 1 | 37 ℃ 5 منٹ | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (فلوروسینس جمع کریں) |
مسائل کے تجزیہ کے لیے رہنما
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
کوئی آر این اے نہیں نکالا جا سکتا ہے یا نیوکلک ایسڈ کی پیداوار کم ہے۔
عام طور پر بہت سے عوامل ہیں جو بحالی کی کارکردگی کو متاثر کرتے ہیں، جیسے: نمونہ آر این اے مواد، آپریشن کا طریقہ، اخراج کا حجم، وغیرہ۔
عام وجوہات کا تجزیہ:
1. آپریشن کے دوران برف کا غسل یا کم درجہ حرارت (4 ° C) سینٹرفیوگریشن۔
تجویز: کمرے کا درجہ حرارت (15-25 ° C) آپریشن، کبھی برف سے نہانا اور کم درجہ حرارت سینٹری فیوج۔
2. بہت لمبے عرصے تک نمونے کا نامناسب ذخیرہ یا نمونہ ذخیرہ۔
تجویز: نمونوں کو -80 ° C پر ذخیرہ کریں یا مائع نائٹروجن میں منجمد کریں، اور بار بار منجمد کرنے سے گریز کریں۔RNA نکالنے کے لیے تازہ جمع کیے گئے نمونے استعمال کرنے کی کوشش کریں۔
3. ناکافی نمونہ لیسس
تجویز: براہ کرم یقینی بنائیں کہ نمونہ اور کام کرنے والے محلول (لینیئر ایکریلامائڈ) کو اچھی طرح سے ملایا گیا ہے اور کمرے کے درجہ حرارت (15-25 ° C) پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا ہے۔
4. eluent غلط طریقے سے شامل کیا گیا تھا
تجویز: یقینی بنائیں کہ RNase-Free ddH2O کو پیوریفیکیشن کالم کی جھلی کے بیچ میں شامل کیا گیا ہے۔
5. بفر viRW2 میں اینہائیڈروس ایتھنول کا نامناسب حجم
تجویز: براہ کرم ہدایات پر عمل کریں، بفر viRW2 میں اینہائیڈروس ایتھنول کا صحیح حجم شامل کریں اور کٹ استعمال کرنے سے پہلے انہیں اچھی طرح مکس کریں۔
6. نمونے کا غلط استعمال۔
تجویز: 200µl نمونہ فی 500μl بفر viRL۔ضرورت سے زیادہ نمونے کے حجم کے نتیجے میں RNA نکالنے کی شرح کم ہو جائے گی۔
7. نامکمل اخراج کا حجم یا نامکمل اخراج۔
تجویز: صاف کرنے والے کالم کا ایلیونٹ حجم 30-50μl ہے۔اگر اخراج کا اثر تسلی بخش نہیں ہے تو پہلے سے گرم RNase-Free ddH شامل کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔2O اور کمرے کے درجہ حرارت پر رکھنے کا وقت بڑھائیں، جیسے 5-10 منٹ
8. بفر viRW2 میں کلی کرنے کے بعد پیوریفیکیشن کالم میں ایتھنول کی باقیات ہوتی ہیں۔
تجویز: اگر بفر viRW2 میں کلی کرنے کے بعد بھی ایتھنول باقی رہتا ہے اور خالی ٹیوب سینٹرفیوگریشن 2 منٹ تک، پیوریفیکیشن کالم کو خالی ٹیوب سینٹرفیوگریشن کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے چھوڑا جا سکتا ہے تاکہ بقیہ ایتھنول کو مکمل طور پر ہٹایا جا سکے۔
صاف شدہ آر این اے مالیکیولز کا انحطاط
پیوریفائیڈ آر این اے کا معیار نمونہ ذخیرہ کرنے، آر نیس کی آلودگی اور آپریشن جیسے عوامل سے متعلق ہے۔
عام وجوہات کا تجزیہ:
1. جمع کیے گئے نمونے وقت پر محفوظ نہیں کیے گئے تھے۔
تجویز: اگر نمونہ جمع کرنے کے بعد وقت پر استعمال نہیں کیا جاتا ہے، تو براہ کرم اسے فوری طور پر -80 ℃ یا مائع نائٹروجن پر اسٹور کریں۔RNA مالیکیولز کو نکالنے کے لیے، جب بھی ممکن ہو تازہ جمع کیے گئے نمونے استعمال کرنے کی کوشش کریں۔
2. جمع کیے گئے نمونے بار بار منجمد اور پگھل رہے تھے۔
تجویز: نمونہ جمع کرنے اور ذخیرہ کرنے کے دوران بار بار جمنے اور پگھلنے سے گریز کریں (ایک سے زیادہ نہیں) ورنہ نیوکلک ایسڈ کی پیداوار کم ہو جائے گی۔
3.RNase کو آپریٹنگ روم میں متعارف کرایا گیا تھا یا کوئی ڈسپوزایبل دستانے، ماسک وغیرہ نہیں پہنے گئے تھے۔
تجویز: آر این اے مالیکیولز کو نکالنے کا تجربہ الگ آر این اے آپریشن روم میں بہترین کارکردگی کا مظاہرہ کیا جاتا ہے، اور تجرباتی میز کو تجربے سے پہلے صاف کیا جاتا ہے۔تجربے کے دوران ڈسپوزایبل دستانے اور ماسک پہنیں تاکہ RNase کے تعارف کی وجہ سے آر این اے کے انحطاط سے بچا جا سکے۔
4. استعمال کے دوران ریجنٹ RNase سے آلودہ ہوتا ہے۔
تجویز: متعلقہ تجربات کے لیے نئی وائرل RNA آئسولیشن کٹ کے ساتھ تبدیل کریں۔
5. سینٹری فیوج ٹیوبوں، پائپیٹ ٹپس وغیرہ کی RNase آلودگی۔ تجویز: اس بات کو یقینی بنائیں کہ سینٹری فیوج ٹیوبیں، پائپیٹ ٹپس، اور پائپیٹ سبھی RNase سے پاک ہیں۔
صاف شدہ آر این اے مالیکیولز نے بہاو کے تجربات کو متاثر کیا۔
پیوریفیکیشن کالم سے پاک ہونے والے آر این اے مالیکیولز بہاوی تجربات کو متاثر کریں گے اگر نمک کے آئن یا پروٹین بہت زیادہ ہوں، جیسے: ریورس ٹرانسکرپشن، ناردرن بلاٹ وغیرہ۔
1. ایلوٹڈ RNA مالیکیولز میں نمک کے آئن باقی ہیں۔
تجویز: یقینی بنائیں کہ اینہائیڈروس ایتھنول کا صحیح حجم بفر viRW2 میں شامل کیا گیا ہے، اور آپریٹنگ ہدایات پر درست سینٹرفیوگریشن اسپیڈ کے مطابق پیوریفیکیشن کالم کو دو بار دھوئیں؛ اگر اب بھی نمک کے آئن باقی ہیں، تو آپ بفر viRW2 کو پیوریفیکیشن کالم میں شامل کر سکتے ہیں، اور اسے کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ تک چھوڑ دیں۔پھر سب سے زیادہ حد تک نمک کے آئنوں کی آلودگی کو دور کرنے کے لیے سینٹرفیوگریشن انجام دیں۔
2. ایلوٹڈ آر این اے مالیکیولز میں ایتھنول باقی ہیں۔
تجویز: ایک بار اس بات کی تصدیق کرنے کے بعد کہ بفر viRW2 کے ذریعہ پیوریفیکیشن کالموں کو کلی کیا گیا ہے، آپریٹنگ ہدایات پر سینٹرفیوگل رفتار کے مطابق خالی ٹیوب سینٹرفیوگریشن انجام دیں۔اگر اب بھی ایتھنول باقی ہے، تو اسے خالی ٹیوب سینٹرفیوگریشن کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے چھوڑا جا سکتا ہے تاکہ بقیہ ایتھنول کو زیادہ سے زیادہ حد تک نکالا جا سکے۔
ہدایت نامہ:
وائرل آر این اے آئسولیشن کٹ انسٹرکشن مینول
