مسئلہ تجزیہ گائیڈ

آپ کو جن مسائل کا سامنا ہو سکتا ہے ان کا درج ذیل تجزیہپلانٹ ٹوٹلRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

اسپن کالم بھرا ہوا ہے۔

اسپن کالم کی رکاوٹ آر این اے کی پیداوار کو کم کرنے یا RNA حاصل کرنے کے لیے صاف کرنے کے قابل نہ ہونے کا سبب بنے گی، اور حاصل کردہ RNA کا معیار کم ہوگا۔

عام وجہ کا تجزیہ:

1. نمونہ مکمل طور پر ٹوٹا نہیں ہے.

نامکمل نمونے کے ٹکڑے کرنے سے DNA-کلیننگ کالم بلاک ہو سکتا ہے، جو RNA کی پیداوار اور معیار کو بھی متاثر کر سکتا ہے۔ہم تجویز کرتے ہیں کہ نمونے کے ٹکڑے کرنے کے دوران، جلد سے زیادہ مقدار میں مائع نائٹروجن کو پیس لیں تاکہ ٹشوز جیسے سیل کی دیواروں اور نمونوں کی سیل کی جھلیوں کو زیادہ سے زیادہ توڑ دیا جا سکے۔پولیفینول پولی سیکرائڈز کے پودوں کے نمونوں کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ پلس استعمال کریں۔

2. DNA-کلیننگ کالم الگ تھلگ سپرنیٹنٹ کو اسپائریٹ کریں، ممکنہ سیل ملبے کی گولی کو اسپیریٹ کریں۔

آر این اے جذب کرنے کے طریقہ کار کے دوران خواہش مند سیل ملبے کی گولی صرف RNA کالم کو روک سکتی ہے (طریقہ کار کا مرحلہ 5، پولی سیکرائڈ پولیفینول طریقہ کار کا مرحلہ 6 دیکھیں)۔ہم تجویز کرتے ہیں کہ سیل کے ملبے کو خواہش مند ہونے سے بچنے کے لئے اس سپرنٹنٹ کی خواہش کرتے وقت احتیاط برتی جائے۔

3. نمونے کی ابتدائی مقدار بہت زیادہ ہے۔

نمونے کے زیادہ استعمال کے نتیجے میں بفر PRL1 یا Buffer PSL1 کے ذریعے نمونے کے نامکمل ٹکڑے یا خلیات کے نامکمل لیسز ہوں گے، جس کے نتیجے میں پیوریفیکیشن آپریشنز کے لیے صاف کرنے کا کالم بند ہو جائے گا۔پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ میں ابتدائی زیادہ سے زیادہ 50 ملی گرام فی ایک آپریشن شدہ نمونہ ہے۔پولیفینول پولی سیکرائڈز کے پودوں کے نمونوں کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ پلس کو آزمائیں۔

4. سینٹری فیوج کا درجہ حرارت بہت کم ہے۔

مکمل آر این اے تنہائی اور تطہیر کے علاوہ نمونے کے ٹشو کے مائع نائٹروجن میں خلل کے، تمام اقدامات کمرے کے درجہ حرارت (20-25 °C) پر کیے جاتے ہیں۔کچھ کم درجہ حرارت والے سینٹری فیوجز کا درجہ حرارت 20 °C سے کم ہوتا ہے، جو DNA-کلیننگ کالم اور/یا صرف RNA-کالم میں رکاوٹوں کا سبب بن سکتا ہے۔اگر ایسا ہوتا ہے تو، سینٹری فیوج کا درجہ حرارت 20-25 °C پر سیٹ کریں اور lysis کے مکسچر کو پہلے سے گرم کریں اور/یا ایتھنول سیپریشن سپرناٹینٹ کو 37 °C پر شامل کریں۔

کوئی آر این اے نہیں نکالا گیا یا آر این اے کی پیداوار کم ہے۔

عام طور پر بہت سے عوامل ہیں جو بحالی کی کارکردگی کو متاثر کرتے ہیں، جیسے: نمونہ آر این اے مواد، آپریشن کا طریقہ، اخراج کا حجم، وغیرہ۔

ذیل میں عام وجوہات کا تجزیہ:

1. آپریشن کے دوران برف کا غسل یا کم درجہ حرارت (4°C) سینٹرفیوگریشن کیا گیا تھا۔

تجویز: پورے عمل میں کمرے کے درجہ حرارت (15-25 ° C) پر کام کریں، برف سے غسل اور کم درجہ حرارت کی سینٹرفیوگریشن نہ کریں۔

       2.نمونے کے نامناسب تحفظ یا نمونے کے طویل مدتی تحفظ کی وجہ سے آر این اے کی تنزلی ہوئی ہے۔

تجویز: تازہ جمع کیے گئے نمونوں کو فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد کیا جانا چاہیے، اور پھر -80 ° C پر طویل عرصے تک ذخیرہ کیا جانا چاہیے، نمونوں کو بار بار جمانے اور پگھلنے سے گریز کریں۔یا فوری طور پر نمونوں کو RNA سٹیبلائزر RNAlater محلول (جانوروں کے نمونے) میں بھگو دیں۔

       3.ناکافی نمونے کے ٹکڑے اور lysis پیوریفیکیشن کالم کی رکاوٹ کا باعث بنتے ہیں۔

تجویز: ٹشو کو پیستے وقت، براہ کرم یقینی بنائیں کہ ٹشو کافی حد تک گراؤنڈ ہے، اور اسے جلدی سے پہلے سے تیار شدہ بفر PSL1 میں منتقل کریں (تصدیق کریں کہ β-ME کا صحیح تناسب شامل کیا گیا ہے، طریقہ کار کا مرحلہ 1 دیکھیں)۔

4. eluent غلط طریقے سے شامل کیا گیا تھا.

تجویز: یقینی بنائیں کہ RNase فری ddH₂O کو صاف کرنے والے کالم کی جھلی کے وسط میں ٹپکایا جاتا ہے۔

5. Buffer PSL2 یا Buffer PRW2 میں مطلق ایتھنول کا صحیح حجم شامل نہیں کیا گیا تھا۔

تجویز: براہ کرم ہدایات پر عمل کریں، Buffer PSL2 اور Buffer PRW2 میں مطلق ایتھنول کا صحیح حجم شامل کریں اور کٹ استعمال کرنے سے پہلے اچھی طرح مکس کریں۔

6. ٹشو کے نمونے کی مقدار نامناسب ہے۔

تجویز: بفر پی ایس ایل 1 کے 500 μl فی 50 ملی گرام ٹشو استعمال کریں۔بہت زیادہ ٹشو استعمال کرنے سے نکالے جانے والے RNA کی مقدار کم ہو جائے گی اور نتیجے میں RNA کی پاکیزگی بھی کم ہو جائے گی۔ہم پرزور مشورہ دیتے ہیں کہ ابتدائی نمونے کی خوراک 50 ملی گرام فی RNA نکالنے کے آپریشن سے زیادہ نہیں ہونی چاہیے۔

7. نامناسب اخراج کا حجم یا نامکمل اخراج۔

تجویز: صاف کرنے والے کالم کا ایلیونٹ حجم 50-200 μl ہے۔اگر اخراج کا اثر تسلی بخش نہیں ہے تو، پہلے سے گرم RNase-Free ddH شامل کرنے کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر وقت بڑھانے کی سفارش کی جاتی ہے۔₂O، جیسے 5-10 منٹ۔

8. پیوریفیکیشن کالم میں بفر PRW2 سے دھونے کے بعد ایتھنول کی باقیات ہوتی ہیں۔

   تجویز: اگر خالی ٹیوب کو 1 منٹ کے لیے سینٹری فیوج کیا جاتا ہے اور بفر PRW2 میں دھونے کے بعد بھی ایتھنول باقی رہ جاتا ہے، تو آپ خالی ٹیوب سینٹرفیوگریشن کے وقت کو 2 منٹ تک بڑھا سکتے ہیں، یا بقیہ ایتھنول کو مکمل طور پر ہٹانے کے لیے پیوریفیکیشن کالم کو کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے رکھ سکتے ہیں۔

9. کٹ کا غلط استعمال کیا گیا تھا۔

   تجویز: پولی فینولک پولی سیکرائڈز کے پودوں کے نمونوں کے لیے، پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ جیسی عام کٹس کا استعمال مثالی آر این اے نمونے حاصل کرنے کے قابل نہیں ہو سکتا۔ہم آپ کو پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ پلس استعمال کرنے کا مشورہ دیتے ہیں، جو خاص طور پر پولی فینولک پولی سیکرائیڈ پلانٹ کے نمونوں کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔پولی فینول اور پولی سیکرائیڈ پلانٹ کے نمونوں سے RNA نکالنے کے لیے خصوصی طور پر تیار کردہ ایک کٹ۔

OD260/OD280 قدر کم ہے۔

ڈی ڈی ایچ کے ساتھ آر این اے کا اخراج₂O اور سپیکٹرو فوٹومیٹر ریڈنگ کے لیے استعمال ہونے کے نتیجے میں OD260/OD280 قدریں کم ہوتی ہیں۔ہم 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 (RNase-free ddH کے بجائے) استعمال کرنے کی تجویز کرتے ہیں₂آر این اے کو ختم کرنے کے لیے O) نسبتاً درست OD260/OD280 اقدار حاصل کرنے کے لیے صفحہ 19 پر "RNA Concentration and Purification Assays" دیکھیں۔

پیوریفائیڈ آر این اے انحطاط پذیر ہے۔

پیوریفائیڈ آر این اے کا معیار نمونے کے تحفظ، آر نیس کی آلودگی، اور ہیرا پھیری جیسے عوامل سے متعلق ہے۔

عام وجوہات کا تجزیہ:

1. ٹشو کے نمونے جمع کرنے کے بعد وقت پر محفوظ نہیں کیے گئے تھے۔

    تجویز: اگر ٹشو کے نمونے جمع کرنے کے بعد وقت پر استعمال نہیں ہوتے ہیں، تو براہ کرم انہیں فوری طور پر کم درجہ حرارت پر مائع نائٹروجن میں ذخیرہ کریں یا مائع نائٹروجن میں فوری جمنے کے بعد طویل مدتی ذخیرہ کرنے کے لیے انہیں -80°C پر منتقل کریں، یا نمونوں کو فوری طور پر RNA سٹیبلائزر RNAlater محلول (جانوروں کے نمونے) میں ڈبو دیں۔RNA نکالنے کے لیے، تازہ جمع کیے گئے بافتوں کے نمونے استعمال کرنے کی کوشش کریں۔

2. ٹشو کے نمونوں کا بار بار جمنا اور پگھلنا۔

   تجویز: ٹشو کے نمونوں کو ذخیرہ کرتے وقت، بہتر ہے کہ انہیں محفوظ کرنے کے لیے چھوٹے چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹ لیا جائے، اور نمونوں کے بار بار جمنے اور پگھلنے کی وجہ سے آر این اے کے انحطاط سے بچنے کے لیے استعمال کرتے وقت ان میں سے کچھ حصہ نکال لیں۔

3.RNase آپریشن روم میں متعارف کرایا جاتا ہے یا اسے ڈسپوزایبل دستانے، ماسک وغیرہ نہیں پہنا جاتا ہے۔

   تجویز: RNA نکالنے کے تجربات کو الگ الگ RNA آپریشنز میں بہترین طریقے سے انجام دیا جاتا ہے، اور تجربہ گاہوں کی میز کو تجربے سے پہلے صاف کیا جانا چاہیے، اور تجربے کے دوران ڈسپوزایبل دستانے اور ماسک پہننے چاہئیں تاکہ RNase کے متعارف ہونے کی وجہ سے RNA کے انحطاط سے بچا جا سکے۔

4. استعمال کے دوران ریجنٹ RNase سے آلودہ ہوتا ہے۔

   تجویز: متعلقہ تجربات کے لیے پودوں کی کل RNA نکالنے والی کٹس کی ایک نئی سیریز سے تبدیل کریں۔

5. آر این اے کی ہیرا پھیری کے لیے استعمال ہونے والی سینٹری فیوج ٹیوبیں اور پائپیٹ کے اشارے RNase سے آلودہ ہیں۔

تجویز: اس بات کو یقینی بنائیں کہ آر این اے نکالنے میں استعمال ہونے والی سینٹری فیوج ٹیوبیں، پِیپٹ ٹِپس، پِیپٹس وغیرہ سبھی RNase سے پاک ہیں۔

ہدایت نامہ:

پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ انسٹرکشن مینوئل