کالم پلگ ہو گیا۔

کالم پلگ ہونے کے بعد، RNA کی پیداوار کم ہو جاتی ہے یا RNA کو صاف کرنا ناممکن ہوتا ہے، اور حاصل شدہ RNA ماس کم ہوتا ہے۔

عام وجوہات کا تجزیہ:

1. نمونے کے وقفے مکمل نہیں ہیں۔

نمونے کا ٹوٹنا DNA-CLEANING COLUMN کو مکمل طور پر بلاک کرنے کا سبب نہیں بنتا، جبکہ RNA کی پیداوار اور معیار کو متاثر کرتا ہے۔جب آپ نمونے توڑتے ہیں تو ہم کافی مائع نائٹروجن میں تیزی سے پیسنے کے آپریشن کی سفارش کرتے ہیں، نمونے کی سیل کی دیوار، سیل کی جھلی اور دیگر بافتوں کو کچلنے کی کوشش کریں۔پولیول پولی سیکرائڈز کے پودوں کے نمونوں کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئیسولیشن کٹ پلس استعمال کریں۔

2. جب ڈی این اے کلیننگ کالم کے ساتھ الگ کیے گئے نمونے کے سپرنیٹنٹ کو سکشن کرتے ہیں، تو ممکنہ سیل کے بکھرے ہوئے حصے کو سانس لیا جا سکتا ہے۔

لی گئی سیل کے ٹکڑے شدہ تلچھٹ RNA-ONLY کالم کا سبب بنیں گے جو RNA جذب کرنے کا عمل انجام دینے پر بلاک ہو جائے گا (مرحلہ 6 دیکھیں)۔سیل کے ملبے کو چوسنے سے بچنے کے لیے اس سپرنیٹنٹ کو سکشن کرتے وقت ہم آپ کو احتیاط سے مشورہ دیتے ہیں۔

3. نمونہ کی ابتدائی رقم بہت زیادہ ہے۔

نمونے کے زیادہ استعمال کے نتیجے میں بفر PSL1 کے ذریعے نمونے کے نامکمل ٹکڑے یا نامکمل سیل لیسز ہوں گے، جس کے نتیجے میں طہارت کے دوران پیوریفیکیشن کالم میں رکاوٹ پیدا ہو جائے گی۔پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ ہر ایک پیوریفائیڈ آپریٹنگ نمونہ 50 ملی گرام ہے۔پولیول پولی سیکرائڈز کے پودوں کے نمونوں کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئیسولیشن کٹ پلس کو آزمائیں۔

4. سینٹری فیوج کا درجہ حرارت بہت کم ہے۔

آر این اے کی تنہائی اور صاف کرنے کا پورا عمل کمرے کے درجہ حرارت پر کیا جاتا ہے (20-25°C)، سوائے اس کے کہ نمونے کے ٹشو مائع نائٹروجن سے ٹوٹے ہوں۔ کچھ کرائیوجینک سینٹری فیوجز کا درجہ حرارت 20 سے کم ہے۔℃، جو DNA-کلیننگ کالم اور/یا RNA-Only کالم کی رکاوٹ کا سبب بن سکتا ہے۔اگر ایسا ہوتا ہے تو، سینٹری فیوج کا درجہ حرارت 20-25 پر سیٹ کریں۔℃، اوراس بات کو یقینی بنائیں کہ لیسز مکسچر اور/یا ایتھنول ایڈڈ سپرنٹنٹ کو 37 پر پہلے سے گرم کیا گیا تھا۔°C.

کوئی آر این اے نہیں نکالا گیا یا آر این اے کی پیداوار کم ہے۔

عام طور پر بہت سے عوامل ہیں جو بحالی کی کارکردگی کو متاثر کرتے ہیں، جیسے: نمونہ آر این اے مواد، آپریشن کا طریقہ، اخراج کا حجم، وغیرہ۔

ذیل میں عام وجوہات کا تجزیہ:

1. آپریشن کے دوران برف کا غسل یا کم درجہ حرارت (4°C) سینٹرفیوگریشن کیا گیا تھا۔

تجویز: کمرے کے درجہ حرارت پر کام کریں (15-25°C) پورے عمل میں، برف کا غسل اور کم درجہ حرارت سینٹرفیوگریشن نہ کریں۔

2. نمونے کے نامناسب تحفظ یا نمونے کے طویل مدتی تحفظ کی وجہ سے آر این اے کی تنزلی ہوئی ہے۔

تجویز: تازہ جمع کیے گئے نمونوں کو فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد کیا جانا چاہیے، اور پھر -80 ° C پر طویل عرصے تک ذخیرہ کیا جانا چاہیے، نمونوں کو بار بار جمانے اور پگھلنے سے گریز کریں۔یا فوری طور پر نمونوں کو RNA سٹیبلائزر RNAlater محلول (جانوروں کے نمونے) میں بھگو دیں۔

3. ناکافی نمونے کے ٹکڑے اور lysis پیوریفیکیشن کالم کی رکاوٹ کا باعث بنتے ہیں۔

تجویز: ٹشو کو پیستے وقت، براہ کرم یقینی بنائیں کہ ٹشو کافی حد تک گراؤنڈ ہے، اور اسے جلدی سے پہلے سے تیار شدہ بفر PSL1 میں منتقل کریں (تصدیق کریں کہ β-ME کا صحیح تناسب شامل کیا گیا ہے، طریقہ کار کا مرحلہ 1 دیکھیں)۔

4. eluent غلط طریقے سے شامل کیا گیا تھا.

تجویز: اس بات کو یقینی بنائیں کہ RNase-Free ddH2O پیوریفیکیشن کالم میمبرین کے وسط میں ٹپک رہا ہے۔

5. Buffer PSL2 یا Buffer PRW2 میں مطلق ایتھنول کا صحیح حجم شامل نہیں کیا گیا تھا۔

تجویز: براہ کرم ہدایات پر عمل کریں، Buffer PSL2 اور Buffer PRW2 میں مطلق ایتھنول کا صحیح حجم شامل کریں اور کٹ استعمال کرنے سے پہلے اچھی طرح مکس کریں۔

6. ٹشو کے نمونے کی مقدار نامناسب ہے۔

تجویز: بفر پی ایس ایل 1 کے 500 μl فی 50 ملی گرام ٹشو استعمال کریں۔بہت زیادہ ٹشو استعمال کرنے سے نکالے جانے والے RNA کی مقدار کم ہو جائے گی اور نتیجے میں RNA کی پاکیزگی بھی کم ہو جائے گی۔ہم پرزور مشورہ دیتے ہیں کہ ابتدائی نمونے کی خوراک 50 ملی گرام فی RNA نکالنے کے آپریشن سے زیادہ نہیں ہونی چاہیے۔

7. نامناسب اخراج کا حجم یا نامکمل اخراج۔

تجویز: صاف کرنے والے کالم کا ایلیونٹ حجم 50-200 μl ہے۔اگر ایلوشن اثر تسلی بخش نہیں ہے، تو کمرے کے درجہ حرارت پر پہلے سے گرم RNase-Free ddH2O شامل کرنے کے بعد وقت بڑھانے کی سفارش کی جاتی ہے، جیسے کہ 5-10 منٹ۔

8. BufferPRW2 کے ساتھ دھونے کے بعد پیوریفیکیشن کالم میں ایتھنول کی باقیات ہوتی ہیں۔

تجویز: اگر خالی ٹیوب کو 1 منٹ کے لیے سینٹری فیوج کیا جاتا ہے اور بفر PRW2 میں دھونے کے بعد بھی ایتھنول باقی رہ جاتا ہے، تو آپ خالی ٹیوب سینٹرفیوگریشن کے وقت کو 2 منٹ تک بڑھا سکتے ہیں، یا بقیہ ایتھنول کو مکمل طور پر ہٹانے کے لیے پیوریفیکیشن کالم کو کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے رکھ سکتے ہیں۔

9. کٹ کا غلط استعمال کیا گیا تھا۔

تجویز: پولی فینولک پولی سیکرائڈز کے پودوں کے نمونوں کے لیے، پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ جیسی عام کٹس کا استعمال مثالی آر این اے نمونے حاصل کرنے کے قابل نہیں ہو سکتا۔ہم آپ کو پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ پلس استعمال کرنے کا مشورہ دیتے ہیں، جو خاص طور پر پولی فینولک پولی سیکرائیڈ پلانٹ کے نمونوں کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔پولی فینول اور پولی سیکرائیڈ پلانٹ کے نمونوں سے RNA نکالنے کے لیے خصوصی طور پر تیار کردہ ایک کٹ۔

OD260/OD280 قدر کم ہے۔

ddH2O کے ساتھ RNA elution اور اسپیکٹرو فوٹومیٹر ریڈنگ کے لیے استعمال ہونے کے نتیجے میں OD260/OD280 قدریں کم ہوتی ہیں۔ہم تجویز کرتے ہیں کہ نسبتاً درست OD260/OD280 اقدار حاصل کرنے کے لیے 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 (RNase-Free ddH2O کے بجائے) استعمال کریں، صفحہ 19 پر "RNA Concentration and Purification Assays" دیکھیں۔

پیوریفائیڈ آر این اے انحطاط پذیر ہے۔

پیوریفائیڈ آر این اے کا معیار نمونے کے تحفظ، آر نیس کی آلودگی، اور ہیرا پھیری جیسے عوامل سے متعلق ہے۔

عام وجوہات کا تجزیہ:

1. ٹشو کے نمونے جمع کرنے کے بعد وقت پر محفوظ نہیں کیے گئے تھے۔

تجویز: اگر ٹشو کے نمونے جمع کرنے کے بعد وقت پر استعمال نہیں ہوتے ہیں، تو براہ کرم انہیں فوری طور پر کم درجہ حرارت پر مائع نائٹروجن میں ذخیرہ کریں یا مائع نائٹروجن میں فوری جمنے کے بعد طویل مدتی ذخیرہ کرنے کے لیے انہیں -80°C پر منتقل کریں، یا نمونوں کو فوری طور پر RNA سٹیبلائزر RNAlater محلول (جانوروں کے نمونے) میں ڈبو دیں۔RNA نکالنے کے لیے، تازہ جمع کیے گئے بافتوں کے نمونے استعمال کرنے کی کوشش کریں۔

2. ٹشو کے نمونوں کا بار بار جمنا اور پگھلنا۔

تجویز: ٹشو کے نمونوں کو ذخیرہ کرتے وقت، بہتر ہے کہ انہیں محفوظ کرنے کے لیے چھوٹے چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹ لیا جائے، اور نمونوں کے بار بار جمنے اور پگھلنے کی وجہ سے آر این اے کے انحطاط سے بچنے کے لیے استعمال کرتے وقت ان میں سے کچھ حصہ نکال لیں۔

3.RNase آپریشن روم میں متعارف کرایا جاتا ہے یا اسے ڈسپوزایبل دستانے، ماسک وغیرہ نہیں پہنا جاتا ہے۔

تجویز: RNA نکالنے کے تجربات کو الگ الگ RNA آپریشنز میں بہترین طریقے سے انجام دیا جاتا ہے، اور تجربہ گاہوں کی میز کو تجربے سے پہلے صاف کیا جانا چاہیے، اور تجربے کے دوران ڈسپوزایبل دستانے اور ماسک پہننے چاہئیں تاکہ RNase کے متعارف ہونے کی وجہ سے RNA کے انحطاط سے بچا جا سکے۔

4. استعمال کے دوران ریجنٹ RNase سے آلودہ ہوتا ہے۔

تجویز: متعلقہ تجربات کے لیے پودوں کی کل RNA نکالنے والی کٹس کی ایک نئی سیریز سے تبدیل کریں۔

5. آر این اے کی ہیرا پھیری کے لیے استعمال ہونے والی سینٹری فیوج ٹیوبیں اور پائپیٹ کے اشارے RNase سے آلودہ ہیں۔

تجویز: اس بات کو یقینی بنائیں کہ آر این اے نکالنے میں استعمال ہونے والی سینٹری فیوج ٹیوبیں، پِیپٹ ٹِپس، پِیپٹس وغیرہ سبھی RNase سے پاک ہیں۔

ہدایت نامہ:

پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ پلس انسٹرکشن مینوئل