1. ابتدائی تفہیم

اس مرحلے پر، ہمیں کچھ تصورات اور اصطلاحات کو سمجھنے کی ضرورت ہے، تاکہ اپنے بزرگوں کے سامنے غلطیاں کرنے سے بچ سکیں، جیسے:

س: آر ٹی پی سی آر، کیو پی سی آر، ریئل ٹائم پی سی آر اور ریئل ٹائم آر ٹی پی سی آر میں کیا فرق ہے؟

جواب: RT-PCR ریورس ٹرانسکرپشن PCR ہے۔(ریورس ٹرانسکرپشن PCR، RT-PCR)، جو کہ پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) کا وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والا مختلف قسم ہے۔RT-PCR میں، ایک RNA اسٹرینڈ کو تکمیلی DNA میں الٹا نقل کیا جاتا ہے، جسے پھر PCR کے ذریعے DNA پروردن کے لیے ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔
ریئل ٹائم پی سی آر اور کیو پی سی آر(Quantitative Rea-ltime-PCR) ایک ہی چیز ہیں، دونوں ریئل ٹائم مقداری PCR ہیں، جس کا مطلب ہے کہ PCR کے ہر سائیکل میں ریئل ٹائم ڈیٹا ریکارڈز ہوتے ہیں، اس لیے ابتدائی ٹیمپلیٹس کی تعداد کو درست تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔

اگرچہ ریئل ٹائم پی سی آر (ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری پی سی آر) اور ریورس ٹرانسکرپشن پی سی آر (ریورس ٹرانسکرپشن پی سی آر) دونوں کو مختصراً RT-PCR کہا جاتا ہے، بین الاقوامی کنونشن یہ ہے: RT-PCR خاص طور پر ریورس ٹرانسکرپشن سے مراد ہے۔پی سی آر، ریئل ٹائم پی سی آر کو عام طور پر کیو پی سی آر (مقدار ریئل ٹائم پی سی آر) کہا جاتا ہے۔.

اور ریئل ٹائم RT-PCR (RT-qPCR)، یہ فلوروسینٹ مقداری ٹیکنالوجی کے ساتھ مل کر ریورس ٹرانسکرپشن PCR ہے: پہلے RNA ریورس ٹرانسکرپشن سے cDNA (RT) حاصل کریں، اور پھر مقداری تجزیہ (qPCR) کے لیے ریئل ٹائم پی سی آر استعمال کریں۔زیادہ تر لیبارٹریز RT-qPCR کرتی ہیں، یعنی RNA ایکسپریشن ڈاؤن ریگولیشن پر تحقیق، اس لیے لیبارٹری میں جس qPCR کے بارے میں ہر کوئی بات کرتا ہے وہ دراصل RT-qPCR سے مراد ہے، لیکن یہ نہ بھولیں کہ کلینیکل ایپلی کیشنز میں ابھی بھی بہت سے DNA ٹیسٹ باقی ہیں۔مقداری تجزیہ، جیسے ہیپاٹائٹس بی وائرس HBV کا پتہ لگانا۔

سوال: فلوروسینٹ مقداری پی سی آر کو بہت زیادہ پڑھنے کے بعد، ایمپلیفائیڈ فریگمنٹ کو 80-300bp کی حد میں کیوں کنٹرول کیا جانا چاہیے؟

جواب دیں۔: ہر جین کی ترتیب کی لمبائی مختلف ہوتی ہے، کچھ کئی kb، کچھ سینکڑوں bp، لیکن ہمیں پرائمر ڈیزائن کرتے وقت صرف مصنوعات کی لمبائی 80-300bp کی ضرورت ہوتی ہے، بہت چھوٹا یا بہت لمبا فلوروسینٹ مقداری PCR کا پتہ لگانے کے لیے موزوں نہیں ہوتا ہے۔پروڈکٹ کا ٹکڑا پرائمر ڈائمر سے ممتاز کرنے کے لیے بہت چھوٹا ہے۔پرائمر-ڈائمر کی لمبائی تقریباً 30-40bp ہے، اور یہ فرق کرنا مشکل ہے کہ آیا یہ پرائمر-ڈائمر ہے یا پروڈکٹ اگر یہ 80bp سے کم ہے۔اگر پروڈکٹ کا ٹکڑا بہت لمبا ہے، 300bp سے زیادہ ہے، تو یہ آسانی سے کم امپلیفیکیشن کی کارکردگی کا باعث بنے گا اور جین کی مقدار کا مؤثر طریقے سے پتہ نہیں لگا سکتا۔

مثال کے طور پر، جب آپ گنتے ہیں کہ کلاس روم میں کتنے لوگ ہیں، تو آپ کو صرف یہ گننا ہوگا کہ وہاں کتنے منہ ہیں۔جب آپ جین کا پتہ لگاتے ہیں تو یہی بات درست ہے، آپ کو صرف ایک جین کی ایک مخصوص ترتیب کا پتہ لگانے کی ضرورت ہوتی ہے جس کی نمائندگی پوری ترتیب کرے گی۔اگر آپ لوگوں کو گننا چاہتے ہیں تو آپ کو منہ اور ناک، کان اور چشمے دونوں کو گننا ہوگا، اور غلطیاں کرنا آسان ہے۔

حیاتیاتی تحقیق کو وسعت دینے کے لیے، جگہ جگہ بہت سے تحقیقی معاملات ہوتے ہیں، کیونکہ کسی بھی نوع کی جین کی ترتیب بہت طویل ہوتی ہے، اس لیے تمام ٹکڑوں کی پیمائش کرنا غیر ضروری اور ناممکن ہے، جیسے کہ بیکٹیریل 16S کی ترتیب، جو کہ بیکٹیریا کی قدامت پسند ترتیب کو انجام دینے کے لیے ایک مخصوص آبادی کی تعداد کا اندازہ لگاتا ہے۔

سوال: کیو پی سی آر پرائمر ڈیزائن کے لیے زیادہ سے زیادہ لمبائی کتنی ہے؟

جواب دیں۔: عام طور پر، پرائمر کی لمبائی تقریباً 20-24bp ہوتی ہے، جو بہتر ہے۔بلاشبہ، ہمیں پرائمر کو ڈیزائن کرتے وقت پرائمر کی ٹی ایم ویلیو پر توجہ دینی چاہیے، کیونکہ یہ اینیلنگ کے بہترین درجہ حرارت سے متعلق ہے۔بہت سے تجربات کے بعد یہ ثابت ہوا ہے کہ 60°C ایک بہتر TM قدر ہے۔اگر اینیلنگ کا درجہ حرارت بہت کم ہے، تو یہ آسانی سے غیر مخصوص پروردن کا باعث بنے گا۔اگر اینیلنگ کا درجہ حرارت بہت زیادہ ہے تو، امپلیفیکیشن کی کارکردگی نسبتاً کم ہوگی، ایمپلیفیکیشن وکر کی چوٹی بعد میں شروع ہوگی، اور CT قدر میں تاخیر ہوگی۔

سوال: ڈائی کا طریقہ تحقیقات کے طریقہ کار سے کیسے مختلف ہے؟

جواب: رنگنے کا طریقہکچھ فلوروسینٹ رنگ، جیسے SYBR گرین Ⅰ، PicoGreen، BEBO، وغیرہ، خود سے روشنی خارج نہیں کرتے ہیں، لیکن ڈبل پھنسے ہوئے DNA کی معمولی نالی سے منسلک ہونے کے بعد فلوروسینس خارج کریں گے۔لہذا، پی سی آر ردعمل کے آغاز میں، مشین فلوروسینٹ سگنل کا پتہ نہیں لگا سکتا.جب رد عمل annealing-extension کے مرحلے تک پہنچ جاتا ہے، تو ڈبل اسٹرینڈ کھول دیا جاتا ہے، اور DNA پولیمریز کے عمل کے تحت ایک نیا اسٹرینڈ ترکیب کیا جاتا ہے، اور فلوروسینٹ مالیکیول dsDNA معمولی نالی سے جڑ جاتا ہے۔جیسے جیسے PCR سائیکلوں کی تعداد میں اضافہ ہوتا ہے، زیادہ سے زیادہ رنگوں کو دوہرے پھنسے ہوئے DNA کے ساتھ ملایا جاتا ہے، اور فلوروسینٹ سگنل کو بھی مسلسل بڑھایا جاتا ہے۔رنگنے کا طریقہ بنیادی طور پر سائنسی تحقیق میں استعمال ہوتا ہے۔
PS: تجربہ کرتے وقت محتاط رہیں، رنگ کو انسانی ڈی این اے کے ساتھ ملانا ہوگا، اسے فلورسنٹ شخص میں تبدیل کرنے میں محتاط رہیں۔

ڈائی طریقہ (بائیں) تحقیقات کا طریقہ (دائیں)
PS: تجربہ کرتے وقت محتاط رہیں، رنگ کو انسانی ڈی این اے کے ساتھ ملانا ہوگا، اسے فلورسنٹ شخص میں تبدیل کرنے میں محتاط رہیں۔

SYBR گرین Ⅰ DNA کی معمولی نالی سے جڑا ہوا ہے۔

تحقیقات کا طریقہتقمان پروب سب سے زیادہ استعمال ہونے والی ہائیڈولیسس پروب ہے۔تحقیقات کے 5′ سرے پر ایک فلوروسینٹ گروپ ہوتا ہے، عام طور پر FAM، اور پروب بذات خود ہدف جین کی تکمیلی ترتیب ہے۔3′ سرے پر فلوروسینٹ بجھانے والا گروپ ہے۔فلوروسینس ریزونینس انرجی ٹرانسفر (Förster resonance energy transfer, FRET) کے اصول کے مطابق، جب رپورٹر فلوروسینٹ گروپ (عطیہ کنندہ فلوروسینٹ مالیکیول) اور بجھانے والا فلوروسینٹ گروپ (قبول کرنے والا فلوروسینٹ مالیکیول) پرجوش ہوتے ہیں جب سپیکٹرا اوورلیپ ہوتا ہے اور فاصلہ بہت قریب ہو جاتا ہے، تو یہ فاصلہ بہت قریب ہوتا ہے۔ قبول کرنے والے مالیکیول کا فلوروسینس، جبکہ آٹو فلوروسینس کمزور ہو جاتا ہے۔لہذا، پی سی آر ردعمل کے آغاز میں، جب تحقیقات آزاد اور نظام میں برقرار ہے، رپورٹر فلوروسینٹ گروپ فلوروسینس کا اخراج نہیں کرے گا.اینیلنگ کرتے وقت، پرائمر اور تحقیقات ٹیمپلیٹ سے منسلک ہوتے ہیں۔توسیع کے مرحلے کے دوران، پولیمریز مسلسل نئی زنجیروں کی ترکیب کرتا ہے۔ڈی این اے پولیمریز میں 5′-3′ exonuclease سرگرمی ہوتی ہے۔تحقیقات تک پہنچنے پر، ڈی این اے پولیمریز ٹیمپلیٹ سے تحقیقات کو ہائیڈولائز کرے گا، رپورٹر فلوروسینٹ گروپ کو بجھانے والے فلوروسینٹ گروپ سے الگ کرے گا، اور فلوروسینٹ سگنل جاری کرے گا۔چونکہ جانچ اور ٹیمپلیٹ کے درمیان ون ٹو ون رشتہ ہے، اس لیے جانچ کا طریقہ ٹیسٹ کی درستگی اور حساسیت کے لحاظ سے ڈائی کے طریقہ کار سے برتر ہے۔جانچ کا طریقہ بنیادی طور پر تشخیص میں استعمال ہوتا ہے۔

سوال: مطلق مقدار کیا ہے؟رشتہ دار مقدار کیا ہے؟

جواب دیں۔: مطلق مقدار سے مراد qPCR کے ذریعے ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کی ابتدائی کاپی نمبر کا حساب ہے، جیسے کہ خون کے 1ml میں کتنے HBV وائرس ہیں۔رشتہ دار کوانٹیفیکیشن کے ذریعے حاصل ہونے والا نتیجہ ایک مخصوص نمونے میں ہدف کے جین کی مقدار میں کسی دوسرے حوالہ نمونے کے مقابلے میں تبدیلی ہے، اور جین کا اظہار اوپر ریگولیٹ یا نیچے ریگولیٹ ہوتا ہے۔

سوال: کیا آر این اے نکالنے کی مقدار، ٹرانسکرپشن کی ریورس کارکردگی، اور ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی تجرباتی نتائج کو متاثر کرے گی؟
سوال: کیا نمونے کا ذخیرہ، نکالنے والے ریجنٹس، ریورس ٹرانسکرپشن ری ایجنٹس، اور روشنی کی ترسیل کرنے والی اشیاء تجرباتی نتائج کو متاثر کریں گی؟
سوال: کون سا طریقہ تجرباتی ڈیٹا کو درست کر سکتا ہے؟

ان مسائل کے بارے میں، ہم ذیل میں جدید اور جدید حصوں میں ان کو تفصیل سے بیان کریں گے۔
2. اعلیٰ درجے کا علم

ریئل ٹائم فلوروسینٹ کوانٹیٹیو پی سی آر کے حوالے سے، ہمیں اس حقیقت کو تسلیم کرنا چاہیے کہ ہر سال ہزاروں سائنسی تحقیقی مقالے شائع ہوتے ہیں، جن میں فلوروسینٹ مقداری پی سی آر ٹیکنالوجی کوئی کم تعداد نہیں ہے۔

اگر فلوروسینٹ مقداری PCR تجربے کی پیمائش کے لیے کوئی عام معیار نہیں ہے، تو نتائج وسیع پیمانے پر مختلف ہو سکتے ہیں۔ایک ہی نسل کے ایک ہی جین کے لیے، ایک ہی طریقہ کار کے ساتھ، پتہ لگانے کے نتائج بھی بڑے پیمانے پر مختلف ہوں گے، اور دیر سے آنے والوں کے لیے وہی نتائج دہرانا مشکل ہوگا۔آپ کو کوئی نہیں جانتا کہ کون سا صحیح ہے اور کون سا غلط۔

کیا اس کا مطلب یہ ہے کہ فلوروسینٹ مقداری پی سی آر ایک دھوکہ دہی کی ٹیکنالوجی ہے یا ایک ناقابل اعتبار ٹیکنالوجی؟نہیں، اس کی وجہ یہ ہے کہ فلوروسینٹ مقداری پی سی آر زیادہ حساس اور زیادہ درست ہے، اور تھوڑا سا غلط آپریشن مکمل طور پر مخالف نتائج دے گا۔ایک چھوٹا سا نقصان ہزار میل دور ہے۔.مضمون کے مصنف کو جائزہ لینے والوں کی طرف سے بار بار تشدد کا نشانہ بنایا جا سکتا ہے۔ایک ہی وقت میں، جریدے کے جائزہ لینے والوں کے لیے مختلف تجرباتی نتائج میں سے انتخاب کرنا بھی مشکل ہے۔

مجموعی طور پر، حقیقی وقت کے پی سی آر تجربات میں اتفاق رائے کی کمی کی طرف اشارہ کرنا۔اس مقصد کے لیے صنعت کے سینئر سائنسدانوں نے معیارات مرتب کرنا شروع کیے،تعاون کنندگان کو ان معیارات پر پورا اترنے کے لیے مضمون میں کچھ ضروری تجرباتی اور ڈیٹا پروسیسنگ کی تفصیلات (بشمول ضروری ڈیٹا) فراہم کرنے کی ضرورت ہے۔

جائزہ لینے والے ان تفصیلات کو پڑھ کر تجربے کے معیار کا اندازہ لگا سکتے ہیں۔مستقبل کے قارئین بھی اس کا استعمال تجربہ کو دہرانے یا تجربے کو بہتر بنانے کے لیے کر سکتے ہیں۔پھر اس طریقے سے حاصل ہونے والے تجرباتی نتائج معلومات سے بھرپور، اعلیٰ معیار اور قابل استعمال ہوتے ہیں۔

MIBBI (حیاتیاتی اور حیاتیاتی تحقیقات کے لیے کم از کم معلومات -http://www.mibbi.org) وجود میں آیا.MIBBI ایک ایسا منصوبہ ہے جو تجربات کے لیے معیارات فراہم کرتا ہے۔.یہ فطرت میں شائع ہوا ہے۔اس پروجیکٹ کا مقصد مختلف حیاتیاتی تجربات ہیں، جن میں سیل بائیولوجی، مائیکرو رے، کیو پی سی آر جن پر ہم ابھی بات کرنے جا رہے ہیں، وغیرہ، اور مخطوطات جمع کرواتے وقت ہر قسم کے تجربے کے لیے فراہم کرتا ہے۔یہ معلومات ہر وقت فراہم کی جانی چاہئے۔

MIBBI پروجیکٹ میں فلوروسینٹ مقداری PCR سے متعلق دو مضامین ہیں، یعنی:
· آر ڈی ایم ایل (ریئل ٹائم پی سی آر ڈیٹا مارک اپ لینگویج) – ریئل ٹائم مقداری پی سی آر ڈیٹا کے لیے ایک منظم زبان اور رپورٹنگ گائیڈ؛
· MIQE (کم از کم معلومات برائے مقداری ریئل ٹائم پی سی آر تجربات کی اشاعت) – ریئل ٹائم مقداری پی سی آر تجربات کے بارے میں مضامین شائع کرنے کے لیے کم از کم معلومات۔
سب سے پہلے، RDML کے بارے میں بات کرتے ہیں، اصطلاحات کی تفصیلات۔

اگر ہر چیز کی کوئی معیاری تعریف نہ ہو تو بحث کو جاری رکھنا ناممکن ہے، یہی وجہ ہے کہ امتحان میں اصطلاحات کی وضاحت بہت ضروری ہے۔
فلوروسینٹ مقداری PCR تجربے میں استعمال ہونے والی اصطلاحات میں درج ذیل مواد شامل ہے۔QIAGEN نے ہمارے لیے بہترین خلاصہ بنایا ہے۔مندرجہ ذیل تمام خشک ہیںسامان .

ایمپلیفیکیشن وکر
ایمپلیفیکیشن وکر PCR عمل کے دوران بنائے گئے وکر سے مراد ہے، جس میں سائیکل نمبر abscissa اور ریئل ٹائم فلوروسینس کی شدت کو ordinate کے طور پر رد عمل کے دوران ہوتا ہے۔

ایک بہترین امپلیفیکیشن وکر میں درج ذیل خصوصیات ہونی چاہئیں: بیس لائن فلیٹ یا قدرے کم ہے، اور اوپر کی طرف کوئی واضح رجحان نہیں ہے۔وکر کا انفلیکشن پوائنٹ واضح ہے، اور ایکسپونینشنل فیز کی ڈھلوان ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کے متناسب ہے۔ڈھلوان جتنی زیادہ ہوگی، امپلیفیکیشن کی کارکردگی اتنی ہی زیادہ ہوگی۔مجموعی امپلیفیکیشن وکر متوازی اچھی ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ہر ٹیوب کی ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی ایک جیسی ہے۔کم ارتکاز کے نمونوں کے ایمپلیفیکیشن وکر کا کفایتی مرحلہ واضح ہے۔

بیس لائن (بیس لائن)
بیس لائن ابتدائی سائیکل کے شور کی سطح ہے۔، عام طور پر 3rd اور 15th سائیکل کے درمیان ماپا جاتا ہے، کیونکہ اس مدت کے دوران ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ کی وجہ سے فلوروسینس ویلیو میں اضافہ کا پتہ نہیں لگایا جا سکتا۔بیس لائن کا حساب لگانے کے لیے استعمال ہونے والے چکروں کی تعداد مختلف ہو سکتی ہے اور اگر ٹیمپلیٹ کی اعلی مقدار استعمال کی جائے یا ہدف جین کا اظہار کی سطح زیادہ ہو تو اسے کم کرنے کی ضرورت پڑ سکتی ہے۔

بیس لائن سیٹ کرنے کے لیے لکیریٹی ایمپلیفیکیشن وکر سے فلوروسینس ڈیٹا دیکھنے کی ضرورت ہوتی ہے۔بیس لائن سیٹ کی گئی ہے تاکہ ایمپلیفیکیشن وکر کی نمو بیس لائن سائیکل ٹاپ نمبر سے زیادہ سائیکل نمبر کے ساتھ شروع ہو۔ہر ہدف کی ترتیب کے لیے بیس لائنز کو انفرادی طور پر سیٹ کرنے کی ضرورت ہے۔ابتدائی دوروں میں پائے جانے والے اوسط فلوروسینس اقدار کو ایمپلیفائیڈ مصنوعات میں حاصل کی گئی فلوروسینس اقدار سے منہا کرنے کی ضرورت ہے۔مختلف ریئل ٹائم پی سی آر سافٹ ویئر کے تازہ ترین ورژن انفرادی نمونوں کے لیے بیس لائن سیٹنگز کی خودکار اصلاح کی اجازت دیتے ہیں۔

پی سی آر ایمپلیفیکیشن ری ایکشن کے پہلے چند چکروں کے دوران، فلوروسینس سگنل زیادہ تبدیل نہیں ہوتا ہے۔سیدھی لکیر تک پہنچنے کو بیس لائن کہا جاتا ہے، لیکن اگر ہم پہلے چند چکروں کو قریب سے دیکھیں تو ہم دیکھیں گے کہ بیس لائن کے اندر وہی ہے جو نیچے کی تصویر میں ہو رہا ہے۔

پس منظر پس منظر سے مراد ہے۔
رد عمل میں غیر مخصوص فلوروسینس قدر۔مثال کے طور پر: غیر موثر فلوروسینس بجھانا؛یا SYBR گرین کے استعمال کی وجہ سے ڈبل پھنسے ہوئے DNA ٹیمپلیٹس کی ایک بڑی تعداد۔سگنل کے پس منظر کے اجزاء کو ریئل ٹائم پی سی آر سافٹ ویئر الگورتھم کے ذریعے ریاضی سے ہٹا دیا جاتا ہے۔

رپورٹر سگنل
رپورٹر سگنل سے مراد وہ فلوروسینٹ سگنل ہے جو SYBR گرین یا فلوروسینٹ طور پر لیبل لگا ہوا ترتیب کے ساتھ مخصوص تحقیقات کے دوران ریئل ٹائم پی سی آر کے ذریعے تیار کیا گیا ہے۔

نارملائزڈ رپورٹر سگنل (RN)
RN سے مراد رپورٹر ڈائی کی فلوروسینس شدت ہے جسے ہر سائیکل پر ماپا جانے والے غیر فعال ریفرنس ڈائی کی فلوروسینس شدت سے تقسیم کیا جاتا ہے۔

غیر فعال حوالہ ڈائی
کچھ ریئل ٹائم پی سی آر میں،فلوروسینٹ ڈائی ROX کو فلوروسینٹ سگنل کو معمول پر لانے کے لیے اندرونی حوالے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔.یہ غلط پائپٹنگ، اچھی پوزیشن، اور فلوروسینس کے اتار چڑھاو کی وجہ سے اچھی طرح سے کی بنیاد پر تغیرات کو درست کرتا ہے۔

فلوروسینس کی حد (حد)
پس منظر کی قیمت کے اوپر اور امپلیفیکیشن وکر کی سطح مرتفع قدر سے نمایاں طور پر نیچے ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔اسے ایمپلیفیکیشن وکر کے لکیری علاقے میں ہونا چاہیے، جو PCR کا پتہ لگانے کی لاگ لکیری رینج کی نمائندگی کرتا ہے۔تھریش ہولڈز کو لاگ ایمپلیفیکیشن کریو ویو میں سیٹ کیا جانا چاہیے تاکہ پی سی آر کا لاگ لائنر فیز آسانی سے پہچانا جا سکے۔اگر ریئل ٹائم پی سی آر میں متعدد ٹارگٹ جینز ہیں، تو ہر ہدف کے لیے حد مقرر کی جانی چاہیے۔عام طور پر، پی سی آر رد عمل کے پہلے 15 سائیکلوں کے فلوروسینس سگنل کو فلوروسینس بیک گراؤنڈ سگنل کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور فلوروسینس تھریشولڈ پی سی آر کے پہلے 3 سے 15 سائیکلوں کے فلوروسینس سگنل کے معیاری انحراف سے 10 گنا زیادہ ہے، اور فلوروسینس تھریشولڈ PCR کے ایکسپوننٹ فیز میں سیٹ کیا جاتا ہے۔عام طور پر، ہر آلے میں استعمال سے پہلے فلوروسینس کی حد مقرر ہوتی ہے۔

سائیکل تھریشولڈ (CT) یا کراسنگ پوائنٹ (CP)
وہ سائیکل جس پر ایمپلیفیکیشن وکر دہلیز کو عبور کرتا ہے (یعنی وہ نقطہ جس پر فلوروسینس کا پتہ لگانے میں نمایاں اضافہ ہوتا ہے)۔CT ایک حصہ ہو سکتا ہے اور ابتدائی ٹیمپلیٹ کی مقدار کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔CT ویلیو ان سائیکلوں کی تعداد کی نمائندگی کرتی ہے جس کا تجربہ کیا گیا ہے جب ہر PCR ری ایکشن ٹیوب میں فلوروسینٹ سگنل مقررہ حد تک پہنچ جاتا ہے۔ہر ٹیمپلیٹ کی CT قدر اور ٹیمپلیٹ کے ابتدائی کاپی نمبر کے لوگارتھم کے درمیان ایک خطی تعلق ہے،ابتدائی کاپی نمبر زیادہ، CT قدر چھوٹی، اور اس کے برعکس.معلوم ابتدائی کاپی نمبر کے ساتھ ایک معیاری کا استعمال کرکے ایک معیاری وکر بنایا جا سکتا ہے، جس میں abscissa CT قدر کی نمائندگی کرتا ہے، اور ordinate ابتدائی کاپی نمبر کے لوگارتھم کی نمائندگی کرتا ہے۔لہذا، جب تک نامعلوم نمونے کی CT قدر حاصل کی جاتی ہے، نمونے کے ابتدائی کاپی نمبر کو معیاری وکر سے شمار کیا جا سکتا ہے۔

ΔCT قدر
ΔCT قدر بیان کرتا ہے۔ٹارگٹ جین اور متعلقہ اینڈوجینس ریفرنس جین CT ویلیو کے درمیان فرق، جیسے کہ ہاؤس کیپنگ جین، اور استعمال شدہ ٹیمپلیٹ کی مقدار کو معمول پر لانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے:
⇒ΔCT = CT (ٹارگٹ جین) - CT (اینڈوجینس حوالہ جین)

ΔΔCT قدر
ΔΔCT قدر دلچسپی کے نمونے کی اوسط ΔΔCT قدر (مثلاً، محرک خلیات) اور حوالہ نمونے کی اوسط ΔΔCT قدر (مثلاً، غیر محرک خلیات) کے درمیان فرق کو بیان کرتی ہے۔حوالہ کے نمونے کو انشانکن نمونہ بھی کہا جاتا ہے اور دیگر تمام نمونوں کو رشتہ دار مقدار کے لیے اس سے معمول بنایا جاتا ہے:
⇒ΔΔCT = اوسط ΔCT (دلچسپی کا نمونہ) - اوسط ΔCT (حوالہ نمونہ)

اینڈوجینس ریفرنس جینز (اینڈوجینس ریفرنس جینز)
اینڈوجینس ریفرنس جینز کے اظہار کی سطح، جیسے ہاؤس کیپنگ جینز (ہاؤس کیپنگ جین)، نمونوں کے درمیان مختلف نہیں ہیں۔حوالہ جین کی CT اقدار کا ہدف جین سے موازنہ کرنے سے ہدف جین کے اظہار کی سطح کو ان پٹ RNA یا cDNA کی مقدار سے معمول پر لانے کی اجازت ملتی ہے (اوپر ΔCT اقدار پر سیکشن دیکھیں)۔

اندرونی حوالہ جین کے لیے درستممکنہ RNA انحطاط یا RNA نمونوں میں انزائم روکنے والوں کی موجودگی کے ساتھ ساتھ RNA کے مواد میں تغیرات، ٹرانسکرپشن کی ریورس کارکردگی، نیوکلک ایسڈ کی بازیابی، اور نمونے کو سنبھالنا۔بہترین حوالہ جین (جین) کو منتخب کرنے کے لیے، ہم نے الگورتھم میں ترمیم کی تاکہ تجرباتی ترتیب پر منحصر بہترین حوالہ کے انتخاب کی اجازت دی جا سکے۔

اندرونی کنٹرول
ایک کنٹرول ترتیب جو ہدف کی ترتیب کی طرح ایک ہی رد عمل میں بڑھایا جاتا ہے اور مختلف تحقیقات کے ساتھ جانچ پڑتال کرتا ہے (یعنی ڈوپلیکس پی سی آر انجام دینا)۔اندرونی کنٹرول اکثر ناکام امپلیفیکیشنز کو مسترد کرنے کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں، جیسے کہ جب ہدف کی ترتیب کا پتہ نہیں چلتا ہے۔
انشانکن نمونہ
ایک حوالہ نمونہ (مثال کے طور پر سیل لائن یا ٹشو سے پیوریفائیڈ RNA) رشتہ دار مقدار میں استعمال کیا جاتا ہے تاکہ کسی جین کے متعلقہ اظہار کی سطح کا تعین کرنے کے لیے دیگر تمام نمونوں کا موازنہ کیا جا سکے۔انشانکن کا نمونہ کوئی بھی نمونہ ہو سکتا ہے، لیکن عام طور پر ایک کنٹرول ہوتا ہے (مثال کے طور پر، علاج نہ کیا گیا نمونہ یا تجربہ کے وقت صفر کا نمونہ)۔

مثبت کنٹرولز
کے ساتھ کنٹرول ردعمل کا استعمال کریںٹیمپلیٹ کی معلوم مقدار.مثبت کنٹرول اکثر یہ جانچنے کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں کہ پرائمر سیٹ یا پرائمر–تحقیقات کا سیٹ صحیح طریقے سے کام کر رہا ہے اور یہ کہ رد عمل درست طریقے سے ترتیب دیا گیا ہے۔

کوئی ٹیمپلیٹ کنٹرول نہیں (NTC)
ایک کنٹرول ری ایکشن جس میں امپلیفیکیشن ری ایکشن کے تمام ضروری اجزاء ہوتے ہیں سوائے ٹیمپلیٹ کے، جسے عام طور پر پانی سے تبدیل کیا جاتا ہے۔این ٹی سی کا استعمال ریجنٹ آلودگی یا غیر ملکی ڈی این اے کی وجہ سے ہونے والی آلودگی کا پتہ لگا سکتا ہے، اس طرح پتہ لگانے والے ڈیٹا کی صداقت اور وشوسنییتا کو یقینی بنایا جا سکتا ہے۔این ٹی سی کنٹرول کو بڑھانا آلودگی کی نشاندہی کرتا ہے۔

کوئی RT کنٹرول نہیں (NRT)
آر این اے نکالنے کے عمل میں بقایا جینومک ڈی این اے ہو سکتا ہے، جو کہ انتہائی نقصان دہ ہے اور ڈیٹا کے معیار کو متاثر کرنے والا مجرم اور کیو پی سی آر کا قدرتی دشمن ہے، اس لیے تجربات کو ڈیزائن کرتے وقت، اسے صرف آر این اے کی کھوج کو بڑھانے کے لیے ڈیزائن کیا جانا چاہیے۔اس کے دو طریقے ہیں، ایک یہ ہے کہ پرائمر کو انٹرن پر ڈیزائن کیا جائے، دوسرا DNA کو مکمل طور پر ہٹا دیا جائے، کون سا بہتر ہے، جس پر بعد میں بات کی جائے گی۔این ٹی آر کنٹرول ڈی این اے کی آلودگی کا پتہ لگانے کے لیے ایک جادوئی آئینہ ہے۔اگر پروردن ہے تو اس کا مطلب ہے کہ آلودگی ہے۔

معیارات
معیارات معلوم ارتکاز یا کاپی نمبر کے نمونے ہیں جو معیاری وکر بنانے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔معیار کے استحکام کو یقینی بنانے کے لیے، جین کے ٹکڑے کو عام طور پر پلاسمڈ میں کلون کیا جاتا ہے اور معیاری کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔

معیاری وکر
عام طور پر دوگنا تناسب کے مطابق معیاری مصنوع کے ساتھ کم از کم 5 ارتکاز میلان میں گھٹا دیا جاتا ہے، اور CT ویلیو اور کاپی نمبر کے نقاط میں 5 پوائنٹس بنائے جاتے ہیں، اور پوائنٹس ایک معیاری منحنی خطوط پیدا کرنے کے لیے ایک لکیر بنانے کے لیے منسلک ہوتے ہیں۔ہر معیاری وکر کے لیے، اس کی درستگی کی جانچ پڑتال کی ضرورت ہے۔ڈھلوان کی قدر -3.3 اور -3.8 کے درمیان آتی ہے، اور ہر ارتکاز کو سہ رخی میں انجام دیا جاتا ہے۔جو پوائنٹس دوسرے پوائنٹس سے نمایاں طور پر مختلف ہیں انہیں ضائع کر دینا چاہیے۔ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کی CT قدر کو معیاری وکر میں لایا جاتا ہے، اور ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کے اظہار کی سطح کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔

ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کی CT قدر کو معیاری وکر میں لایا جاتا ہے، اور ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کی ابتدائی کاپی نمبر کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔

کارکردگی اور ڈھلوان
معیاری وکر کی ڈھلوان ریئل ٹائم پی سی آر کی کارکردگی کو ظاہر کرتی ہے۔
-3.322 کی ڈھلوان اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی 1، یا 100٪ موثر ہے، اور ہر چکر میں پی سی آر پروڈکٹ کی مقدار دوگنی ہوجاتی ہے۔
-3.322 سے کم ڈھلوان (مثال کے طور پر -3.8) پی سی آر کی کارکردگی کی نشاندہی کرتی ہے۔
· -3.322 سے زیادہ ڈھلوان (مثال کے طور پر -3.0) ظاہر کرتا ہے کہ پی سی آر کی کارکردگی 100٪ سے زیادہ دکھائی دیتی ہے، جو کہ دلچسپ ہے، پی سی آر کا ایک سائیکل ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ سے دوگنا سے زیادہ کیسے پیدا کرسکتا ہے؟یہ صورت حال پی سی آر کے رد عمل کے غیر لکیری مرحلے میں ہوتی ہے، یعنی غیر مخصوص امپلیفیکیشن کی ایک بڑی مقدار ہوتی ہے۔

پگھلنے والی وکر
کیو پی سی آر ایمپلیفیکیشن مکمل ہونے کے بعد، پی سی آر پروڈکٹ کو گرم کیا جاتا ہے۔جیسے جیسے درجہ حرارت بڑھتا ہے، ڈبل پھنسے ہوئے امپلیفیکیشن پروڈکٹ آہستہ آہستہ پگھل جاتی ہے، جس کے نتیجے میں فلوروسینس کی شدت میں کمی واقع ہوتی ہے۔جب ایک مخصوص درجہ حرارت (Tm) تک پہنچ جاتا ہے، تو مصنوعات کی ایک بڑی تعداد پگھل جائے گی۔فلوروسینس تیزی سے گرتا ہے۔مختلف پی سی آر پروڈکٹس میں مختلف ٹی ایم ویلیوز اور مختلف پگھلنے والے درجہ حرارت ہوتے ہیں، تاکہ پی سی آر کی مخصوصیت کی نشاندہی کی جا سکے۔

پگھلنے والا وکر (ماخوذ وکر)
پگھلنے کا وکر ایک چوٹی کا نقشہ بنانے کے لیے اخذ کیا گیا ہے، جو PCR پروڈکٹ کے ٹکڑوں کی صورت حال کو زیادہ بدیہی طور پر ظاہر کر سکتا ہے۔چونکہ پگھلنے کا درجہ حرارت DNA ٹکڑے کی Tm قدر ہے، اس لیے کچھ پیرامیٹرز جو DNA ٹکڑے کی Tm قدر کو متاثر کرتے ہیں، کا اندازہ لگایا جا سکتا ہے، جیسے ٹکڑے کا سائز، GC مواد وغیرہ۔ عام طور پر، ہمارے پرائمر ڈیزائن کے اصولوں کے مطابق،ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کی لمبائی 80-300bp کی حد میں ہے، اس لیے پگھلنے کا درجہ حرارت 80°C اور 90°C کے درمیان ہونا چاہیے۔

پگھلنے والے وکر کی تشریح: اگر واحد اہم چوٹی 80°C-90°C کے درمیان ظاہر ہوتی ہے، تو اس کا مطلب ہے کہ فلوروسینٹ مقداری PCR کامل ہے۔اگر مرکزی چوٹی 80°C-90°C کے درمیان ظاہر ہوتی ہے اور متفرق چوٹیاں 80°C سے نیچے ظاہر ہوتی ہیں تو بنیادی طور پر پرائمر ڈائمر کو سمجھا جاتا ہے۔آپ اسے حل کرنے کے لیے اینیلنگ کا درجہ حرارت بڑھانے کی کوشش کر سکتے ہیں۔اگر مرکزی چوٹی 80°C-90°C کے درمیان ظاہر ہوتی ہے، اور درجہ حرارت بڑھنے پر متفرق چوٹی دوبارہ ظاہر ہوتی ہے، تو بنیادی طور پر یہ سمجھا جاتا ہے کہ DNA آلودگی ہے، اور DNA کو تجربے کے ابتدائی مرحلے میں ہٹانے کی ضرورت ہے۔

بلاشبہ، اب بھی کچھ غیر معمولی حالات ہیں، جو ذیل میں ایک ایک کرکے ٹوٹ جائیں گے۔
3. جدید علم

qPCR کرنے کے لیے، مجھے MIQE کہنا ہوگا،کم سے کم معلوماتکی اشاعت کے لیےمقداریریئل ٹائم پی سی آرتجربات - حقیقی وقتی مقداری PCR کے بارے میں مضامین شائع کرنے کے لیے کم از کم معلوماتتجرباتہر کسی کی سمجھ کو آسان بنانے کے لیے، ہم کلیدی مواد کو آسان بنائیں گے۔

آپ انٹرنیٹ پر MIQE کے اصل متن کو تلاش کر سکتے ہیں، اور سب سے اہم بات یہ ہے کہ یہڈیٹا چیک لسٹ جو مضمون شائع کرتے وقت فراہم کرنے کی ضرورت ہے۔ .

جائزہ لینے والے ان تفصیلات کو پڑھ کر تجربے کے معیار کا اندازہ لگا سکتے ہیں۔مستقبل کے قارئین بھی اسے دوبارہ استعمال کرنے یا اس کو بہتر بنانے کے لیے استعمال کر سکتے ہیں۔
غور طلب ہے کہ اس فہرست میں ہر فہرست کی اہمیت کو بالترتیب E یا D سے نشان زد کیا گیا ہے۔اس کا کیا مطلب ہے؟E: ضروری معلومات (جمع کرانا ضروری ہے)؛D: مطلوبہ معلومات (جتنا ممکن ہو فراہم کریں)۔

MIQE (1)- تجرباتی ڈیزائن
بہت سے بدمعاش جنہوں نے اپنی گریجویٹ تعلیم مکمل کرنے کے بعد اپنا دفاع مکمل کر لیا ہے وہ نہیں جانتے ہوں گے کہ کس طرح آزادانہ طور پر ایک تجربہ ڈیزائن کرنا ہے، اپنی نوٹ بک کھولنا ہے، اور وہی کرنا ہے جو استاد انہیں کرنے کو کہے گا۔نتیجے کے طور پر، تجرباتی ڈیزائن سخت نہیں تھا، اور میگزین کے ادارتی شعبہ نے کہا کہ وہ اس تصویر اور اس تصویر کو بنانا چاہتے تھے، اس لیے انہوں نے اسے چکرا کر کیا۔اس طرح بدمعاش بنتے ہیں!

گھر کے قریب، تجربہ کا پہلا اصول طے کرنا ہے۔تجرباتی منطق کی سختی۔.سب سے بنیادی چیز تجرباتی ڈیزائن ہے، اور تجرباتی ڈیزائن کے بارے میں سب سے اہم چیز یہ ہے کہ ہدف کا نمونہ، حوالہ نمونہ (کنٹرول) اور تکرار کی تعداد کو کیسے ترتیب دیا جائے، تاکہ تجرباتی اعداد و شمار کا حوالہ دیا جا سکے، موازنہ کیا جا سکے اور قائل کیا جا سکے۔

ہدف کا نمونہاس نمونے سے مراد ہے جو ہمیں کسی خاص علاج کے بعد ہدف والے جین کا پتہ لگانے کی ضرورت ہے۔حوالہ نمونہبغیر کسی علاج کے نمونہ ہے، جسے حیاتیات میں اکثر وائلڈ ٹائپ کہا جاتا ہے۔

تجرباتی نقلبہت اہم ہیں.عام طور پر، قائل نقل کی تعداد تین سے زیادہ ہونی چاہیے۔یہ فرق کرنا ضروری ہے کہ حیاتیاتی نقل کیا ہے اور تکنیکی نقل کیا ہے۔

حیاتیاتی نقلیں: وہی تصدیقی تجربہ جو مختلف مواد (وقت، پودوں، بیچوں، رد عمل کی پلیٹوں) کے ساتھ کیا گیا۔

حیاتیاتی نقل
آئیے مثال کے طور پر کالی مرچ کے کیڑے مار دوا کے علاج کو لیتے ہیں۔ہم ABC کے تین پودوں پر کیڑے مار ادویات کا اسپرے کرنا چاہتے ہیں، پھر ABC کے تین پودے تین حیاتیاتی نقل ہیں، اور یہ وہی تصدیقی تجربہ ہیں جو مختلف مواد کے ساتھ کیا گیا ہے۔لیکن ایک تجربے کے طور پر، ایک کنٹرول کی ضرور ضرورت ہے، اس لیے ہم پلانٹ A کا تجرباتی گروپ بنانے کے لیے پلانٹ A کی شاخوں میں سے کسی ایک پر سپرے کر سکتے ہیں، اور کنٹرول گروپ بنانے کے لیے پلانٹ A کی دوسری شاخوں پر سپرے نہیں کر سکتے۔B اور C کے لیے بھی ایسا ہی کریں۔

تکنیکی نقلیں (تکنیکی نقلیں): یہ ایک بار بار تجربہ ہے جو آپریشن کی وجہ سے ہونے والی غلطیوں سے بچنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے، جو دراصل ایک ہی مواد میں شامل ایک ڈپلیکیٹ سوراخ ہے۔علاج اور کنٹرول دونوں میں ہدف جین اور اندرونی حوالہ جین کی نقل کی ترتیبات (کم از کم تین) ہونی چاہئیں۔

تکنیکی تکرار
کیڑے مار ادویات کے ساتھ علاج شدہ کالی مرچ کو دوبارہ مثال کے طور پر لیں۔پلانٹ اے کے تجرباتی گروپ کے لیے، ہم نے اس کے ٹارگٹ جین اور اندرونی حوالہ جین کے لیے بالترتیب 1، 2، اور 3 کے تین PCR سوراخ کیے، تاکہ پتہ لگانے کے بعد اوسط لیا جائے۔پلانٹ کے کنٹرول کے لیے اے گروپس کا بھی اسی طرح علاج کیا جاتا ہے۔اسی طرح B اور C پودوں کا بھی یہی علاج کریں۔یہ تکنیکی تکرار ہے۔

یہ بات قابل غور ہے۔جو چیز اعداد و شمار میں داخل ہوتی ہے وہ حیاتیاتی تکرار ہے، اور تکنیکی تکرار یہ جانچنا ہے کہ آیا تجرباتی عمل میں کوئی بے ترتیب مظاہر موجود ہیں، تاکہ تجرباتی نتائج کو قابل اعتبار بنایا جا سکے، یعنی ان کی اوسط لے کر غلطیوں سے بچنا جیسا کہ ہم اکثر کہتے ہیں۔

منفی کنٹرول - NTC اور NRT
NTC (نان ٹیمپلیٹ کنٹرول), بغیر کسی ٹیمپلیٹ کے کنٹرول کا استعمال اس بات کی تصدیق کے لیے کیا جاتا ہے کہ آیا تجرباتی مواد آلودہ ہے۔عام طور پر، پانی ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے.اگر فلوروسینٹ ردعمل ہوتا ہے، تو یہ اشارہ کرتا ہے کہ لیبارٹری میں نیوکلک ایسڈ کی آلودگی واقع ہوئی ہے۔

یہ آلودگی اس سے آتی ہیں: ناپاک پانی، اینڈوجینس ڈی این اے پر مشتمل نا اہل ریجنٹس، پرائمر آلودگی، لیبارٹری کے آلات کی آلودگی، ایروسول آلودگی، وغیرہ، RNase scavengers اور RNase inhibitors استعمال کرنے کی ضرورت ہے۔ایروسول آلودگی کو تلاش کرنا سب سے مشکل ہے۔تصور کریں کہ آپ کی لیبارٹری سموگ کی طرح ہے، جس میں مختلف نیوکلک ایسڈ ہوا میں معلق ہیں۔

NRT (No-Reverse Transscriptase), ریورس ٹرانسکرپشن کے بغیر کنٹرول، ایک منفی کنٹرول کے طور پر غیر ریورس ٹرانسکرپٹڈ RNA ہے، جو gDNA باقیات کا کنٹرول ہے۔

جین ایکسپریشن کرتے وقت، ریورس ٹرانسکرپشن کے بعد سی ڈی این اے کی مقدار کا پتہ لگا کر آر این اے کی مقدار معلوم کی جاتی ہے۔اگر آر این اے کو پاک کرنے پر جی ڈی این اے کی باقیات موجود ہیں، تو یہ تجرباتی نتائج میں غلطیاں پیدا کرے گی، کیونکہ حاصل کردہ اصل نتائج جی ڈی این اے اور سی ڈی این اے ہیں۔مجموعی سطح پر، نہ صرف سی ڈی این اے، جی ڈی این اے کو آر این اے نکالنے کے دوران مکمل طور پر ہٹانے کی ضرورت ہے۔

MIQE (2)- نمونہ معلومات
نام نہاد نمونہ کی معلومات کا مطلب یہ ہے کہ جب ہم qPCR کے بارے میں کوئی مضمون شائع کرتے ہیں، تو ہمیں نمونے کی معلومات کو واضح طور پر بیان کرنا چاہیے، جو کہ مضمون کا ایک ناگزیر حصہ ہے۔اسی طرح، جب ہم نمونوں پر کارروائی کرتے ہیں، تو ہمیں نمونوں کی درستگی کو یقینی بنانے کے لیے اپنی کارروائیوں کو بھی منظم کرنا چاہیے۔

نمونے کی تفصیل صرف ایک نتیجہ ہے، اور ہمیں پورے تجربے کے دوران لیے گئے مواد پر زیادہ توجہ دینی چاہیے۔

تجرباتی مواد کا انتخاب
خون کے نمونے - تازہ خون کا انتخاب کریں، 4 گھنٹے سے زیادہ نہیں۔سیل کے نمونے - بھرپور نشوونما کے دوران تازہ خلیوں کو جمع کرنے کا انتخاب کریں۔جانوروں کے ٹشو - تازہ، بھرپور طریقے سے بڑھنے والے ٹشو کا انتخاب کریں۔پلانٹ ٹشو - تازہ، جوان ٹشو کا انتخاب کریں۔

آپ نے محسوس کیا ہوگا کہ ان چند جملوں میں ایک کلیدی لفظ ہے: fresh ۔
مندرجہ بالا نمونوں کے لیے، مارکیٹ میں سب سے بہترین، سستی اور مستحکم کٹ Foregene کی کٹ ہے، جو ان کے DNA اور RNA کو جلدی اور آسانی سے نکال سکتی ہے۔

بلڈ ڈی این اے منی کٹ

سیل ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ

جانوروں کی ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ

پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ

پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ پلس

پلانٹ ڈی این اے آئسولیشن کٹ

تجرباتی مواد کا ذخیرہ
عام طور پر، اگر حالات اجازت دیں تو ہم نمونے کو ذخیرہ کرنے کی سفارش نہیں کرتے ہیں۔تاہم، بہت سے دوست ایسے ہیں جو نمونے لینے کے فوراً بعد تجربات نہیں کر سکتے، اور کچھ کو تو مائع نائٹروجن کے ٹینکوں کو نمونے لینے کے لیے کھیت میں لے جانے کی ضرورت ہوتی ہے۔

اس قسم کے محنتی دوست کے لیے، میں صرف اتنا کہہ سکتا ہوں کہ آپ ریجنٹ استعمال کی اشیاء کو نہیں سمجھتے۔اب بہت سی ریجنٹ استعمال کرنے والی کمپنیاں ری ایجنٹ تیار کرتی ہیں جو کمرے کے درجہ حرارت پر آر این اے کے نمونے محفوظ کر سکتی ہیں، اور آپ انہیں استعمال کرنے کا انتخاب کر سکتے ہیں۔روایتی ذخیرہ کرنے کا طریقہ مائع نائٹروجن ذخیرہ ہے، جس میں ایک چھوٹا مائع نائٹروجن ٹینک استعمال کیا جاتا ہے جو لے جانے میں آسان ہے۔نمونے کو دوبارہ لیبارٹری میں لانے کے بعد، اسے -80 ° C کے ریفریجریٹر میں محفوظ کریں۔

RNA پر مشتمل تجربات کے لیے، چھ الفاظ کے اصول پر عمل کرنا ضروری ہے:کم درجہ حرارت، کوئی انزائم نہیں،اورتیز .

کم درجہ حرارت کا تصور سمجھنا آسان ہے۔خامروں کے بغیر، RNase دنیا میں ہر جگہ موجود ہے جس میں ہم رہتے ہیں (ورنہ آپ ایچ آئی وی سے ہلاک ہو چکے ہوتے)، لہذا تجربات کرتے وقت RNase سے کیسے بچنا ہے ایک بہت اہم تصور ہے۔تیز،دنیا میں کوئی کنگ فو نہیں ہے جسے توڑا نہیں جا سکتا، صرف رفتار کو توڑا نہیں جا سکتا.

لہذا، ایک لحاظ سے، نکالنے کا وقت جتنا کم ہوگا، کٹ اتنی ہی بہتر ہوگی۔کیوںفارجینکی کٹ رفتار پر زور دیتی ہے، کیونکہ وہ اسے اچھی طرح جانتے ہیں۔

PS: کچھ لڑکیاں بہت احتیاط سے تجربات کرتی ہیں، لیکن وہ کئی سالوں کے کام کے بعد سلیم ڈنک کی طرح اچھی نہیں ہوتیں۔وہ محسوس کرتے ہیں کہ خدا غیر منصفانہ ہے، دوسروں کے بارے میں شکایت کرتے ہیں، اور زندگی کی تلاش کرتے ہیں.درحقیقت وہ اسے سمجھ نہیں پائی تھی۔اس نے آر این اے کی اچھی طرح حفاظت نہیں کی، اور سلیم ڈنک پلیئر فرتیلا تھا۔جب وہ تجربہ کر رہا تھا تو اس نے سوچا کہ وہ سلیم ڈنک کو تین بار، پانچ بار اور دو ڈویژنوں کے ساتھ ختم کر دے گا، لیکن اس نے تجربہ بخوبی کیا۔

نوٹ: سست، RNase حملے کے زیادہ امکانات۔اپنے آپ کو تیز رفتار ہونے کی تربیت کیسے دیں؟کوئی راستہ نہیں ہے، بس مزید مشق کریں۔

مختلف تجربات اور مختلف نمونوں کے لیے، مزید لٹریچر پڑھنا اور پروسیسنگ کے لیے مناسب طریقہ کا انتخاب کرنا اب بھی ضروری ہے۔نمونہ جمع کرنے اور ذخیرہ کرنے کے عمل کے لیے، MIQE کا تقاضہ ہے کہ اسے کاغذ میں واضح طور پر لکھا جانا چاہیے، تاکہ جائزہ لینے والے کاغذ کی وشوسنییتا کا جائزہ لے سکیں، اور دنگ رہ جانے والے نوجوانوں کے لیے آپ کا تجربہ دہرانا بھی آسان ہے۔

اگرچہ حیاتیاتی تجربات مشکل ہیں، لیکن وہ اعلیٰ درجے کے ہیں۔اگر آپ محتاط نہیں ہیں، تو آپ دنیا کو الٹ سکتے ہیں.مثال کے طور پر، SARS کو بائیو کیمیکل بحران میں تبدیل کرنا، یا 1.3 بلین لوگوں کو بچانے کے لیے ہائبرڈ چاول بنانا۔نیچے دی گئی تصویر ایک کیمیائی تجربہ ہے، آپ کو اس کی ڈک جیسی شکل دیکھ کر سمجھنا چاہیے کہ آپ کو اپنی تحقیق پر کتنا فخر ہے۔اسے بھول جاؤ، اسے کالا نہ کرو۔

MIQE (3) - نیوکلک ایسڈ نکالنا۔
نیوکلک ایسڈ نکالنا ایک بڑا واقعہ ہے، اور تمام سالماتی حیاتیات کے تجربات نیوکلک ایسڈ نکالنے سے شروع ہوتے ہیں۔سب سے پہلے، آئیے نیوکلک ایسڈ نکالنے پر MIQE کے مواد کو کاپی کرتے ہیں۔

اس شکل کو دیکھ کر، آپ سطح پر نہیں رہ سکتے۔شکل ایک عقیدہ ہے۔ایک اعلیٰ طالب علم بننے کے لیے، آپ کو ضرور پوچھنا چاہیے کہ کیوں؟اس جدول کا ضروری مواد ہے: تعاقب کریں۔RNA کی پاکیزگی، سالمیت، مستقل مزاجی اور نکالنے کی مقدار .

کا پہلا حصہعمل یا آلہ نیوکلک ایسڈ نکالنے کا مرحلہ ہے۔اگر آپ نکالنے کے لیے خودکار نیوکلک ایسڈ ایکسٹریکٹر استعمال کرتے ہیں (جدید، براہ کرم خریداری کے لیے مجھ سے رابطہ کریں)، آپ کو آلے کے ماڈل کا نام بتانا ہوگا۔

کٹ کا نام اور

تبدیلی کی تفصیلات کے لیے کون سی کٹ استعمال کی گئی تھی، کون سے خصوصی ریجنٹس شامل کیے گئے تھے یا کون سے خصوصی آپریشن کیے گئے تھے اس کی واضح وضاحت کی جانی چاہیے تاکہ دوسرے آپ کے تجربے کو آسانی سے دہرا سکیں۔

کچھ لوگ خصوصی نمونے نکالتے وقت یہ سوچتے ہوئے کچھ خاص ریجنٹس ڈالتے ہیں کہ یہ ان کا خفیہ ہتھیار ہے اور دوسروں کو نہیں بتاتے۔اسے خفیہ رکھتے ہوئے، وہ آپ کے مضمون کو چمکانے کا موقع بھی کھو دیتے ہیں۔ہوشیار مت بنو، آپ کو سائنسی تحقیق میں ملک کے پرانے ژانگ سے زیادہ ایماندار ہونا پڑے گا، اگر آپ ہوشیار بننا چاہتے ہیں تو مضمون آپ کو بیوقوف بنا دے گا۔

کٹ کا پروڈکٹ نمبر یاد رکھنا چاہیے۔جب آپ کٹ آرڈر کرتے ہیں اور مضمون لکھتے ہیں۔کٹ پر عام طور پر دو نمبر ہوتے ہیں: کیٹ — کیٹلاگ نمبر (پروڈکٹ نمبر، آرٹیکل نمبر)، لاٹ — پروڈکٹ لاٹ نمبر ( یہ بتانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے کہ پروڈکٹ کس بیچ سے آیا ہے)۔

اس کے علاوہ، بائیو کیمیکل ری ایجنٹس کا آرڈر دیتے وقت CAS نمبر اکثر استعمال ہوتا ہے، اور میں اسے مل کر مقبول کروں گا۔CAS نمبر وہ نمبر ہے جو امریکن کیمیکل سوسائٹی کی طرف سے ہر نئی کیمیائی دوا کو دیا جاتا ہے۔عام طور پر، تین نمبر ایک ڈیش کے ذریعے جڑے ہوتے ہیں۔رشوئی کا CAS نمبر: 7732-18-5۔کیمیکل میں اکثر ایک سے زیادہ عرفی نام ہوتے ہیں، لیکن CAS نمبر منفرد ہوتا ہے۔دوا کا آرڈر دیتے وقت، آپ پہلے اس کا CAS نمبر چیک کر سکتے ہیں۔

گھر کے قریب، ہمیں ان چیزوں کو واضح طور پر بیان کرنے کی کیا ضرورت ہے؟درحقیقت، یہ آر این اے نکالنے کے معیار کو بھی چیک کرنا ہے۔آلات اور کٹس کا استعمال آر این اے نکالنے کو مزید مستقل بنائے گا۔عام لیبارٹریوں کا نکالنے کا پیمانہ بڑا نہیں ہوتا اور اسے کٹس سے حاصل کیا جا سکتا ہے۔

DNase یا RNase علاج کی تفصیلات
فلوروسینٹ مقداری پی سی آر کا اہم مسئلہ ڈی این اے کی آلودگی کو روکنا ہے، اور اگر آلودگی ہو تو تجربہ نہ کریں۔لہٰذا، یہ ضروری ہے کہ آپ ڈی این اے پر کارروائی کرنے کے لیے جس عمل کا استعمال کرتے تھے اس کو بیان کریں، تاکہ یہ ظاہر کیا جا سکے کہ تجرباتی عمل میں ڈی این اے کو مکمل طور پر اور مکمل طور پر ہٹا دیا گیا ہے۔اسکیمیٹک ڈایاگرام کے ذریعہ نمائندگی کی گئی ہے۔

آر این اے اور ڈی این اے کا اسکیمیٹک خاکہ
عام طور پر، ڈی این اے کو ہٹانے کا طریقہ یہ ہے کہ نکالنے کے بعد ڈی این اے کے ساتھ آر این اے کا علاج کیا جائے۔تاہم، یہ نسبتاً پرانے طریقے ہیں۔کمرشل RNA نکالنے کی کٹس DNase کو شامل کیے بغیر نکالنے کے عمل کے دوران DNA کو ہٹانے میں کامیاب رہی ہیں۔مثال کے طور پر، Foregene سے کٹس کی ایک سیریز۔

نوٹ: آر این اے نکالنے کے دوران ڈی این اے کو ہٹانا ایک بہت ہی خطرناک دو دھاری تلوار ہے، جو آر این اے نکالنے کے آپریشن کے وقت کو طول دے گی اور آر این اے کے انحطاط کا خطرہ بڑھائے گی۔بنیادی طور پر، یہ آر این اے کی پیداوار اور پاکیزگی کے درمیان تجارت ہے۔

اس کے علاوہ، سلیکا پر مبنی ادسورپشن کالم میں شامل کردہ DNase کی مقدار بہت کم ہے، اور اثر حاصل کرنے کے لیے اعلیٰ معیار کا DNase استعمال کیا جانا چاہیے۔غیر مطلوبہ DNase جلد اور مکمل طور پر ہضم نہیں ہو سکتا۔یہ تاجر کی تکنیکی سطح کا امتحان ہے۔یقینا، اس سے بھی زیادہ عجیب و غریب تاجر ہیں جو اس بات پر فخر کرتے ہیں کہ ڈی این اے کو بغیر ڈی نیس کے ہٹایا جا سکتا ہے۔یہ کہا جا سکتا ہے کہ جو بھی یہ گھمنڈ کرتا ہے کہ ڈی این اے کو بغیر ڈی این اے کے مکمل طور پر ہٹایا جا سکتا ہے وہ غنڈہ ہے۔ڈی این اے نسبتاً مستحکم دوہرا پھنسا ہوا ڈھانچہ ہے، اور اسے صرف بات کرنے اور ہنسنے سے مٹایا نہیں جا سکتا۔

آلودگی کی تشخیص
تشخیص کا طریقہ: الیکٹروفورسس کا پتہ لگانا، 1% ایگروز، 6V/سینٹی میٹر، 15 منٹ، لوڈنگ 1-3 ul

نیوکلک ایسڈ مقداری تجزیہ
عام طور پر یووی سپیکٹرو فوٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے ماپا جاتا ہے۔مجھے پہلے OD260، OD280، اور OD230 کی تین قدروں کے معنی کو مقبول بنانے دیں۔
·OD260nm: یہ نیوکلک ایسڈ کی سب سے زیادہ جذب کرنے والی چوٹی کی جذب طول موج ہے، اور بہترین پیمائش شدہ قدر 0.1 سے 1.0 تک ہوتی ہے۔اگر نہیں، تو نمونے کو رینج میں لانے کے لیے اسے پتلا کریں یا مرتکز کریں۔
·OD280nm: یہ پروٹین اور فینولک مادوں کی سب سے زیادہ جذب کرنے والی چوٹی کی جذب طول موج ہے۔
·OD230nm: یہ کاربوہائیڈریٹ کی سب سے زیادہ جذب کرنے والی چوٹی کی جذب طول موج ہے۔

اگلا، آئیے ہر اشارے کے کردار کے بارے میں بات کرتے ہیں۔A260 کے لیے، اسے نیوکلک ایسڈ کی پیداوار کی پیمائش کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔جب OD260=1، dsDNA=50μg/ml، ssDNA=37μg/ml، RNA=40μg/ml۔

پاکیزگی کے لیے، ہمیں ان تناسب کو دیکھنے کی ضرورت ہے جو ہم عام طور پر دیکھتے ہیں: OD260/280 اور OD260/230۔
خالص ڈی این اے: OD260/280 تقریباً 1.8 کے برابر ہے۔جب یہ 1.9 سے زیادہ ہوتا ہے، تو یہ ظاہر کرتا ہے کہ RNA آلودگی ہے، اور جب یہ 1.6 سے کم ہے، تو یہ اشارہ کرتا ہے کہ پروٹین اور فینول آلودگی ہے۔
خالص آر این اے: 1.7
·OD260/230: چاہے یہ DNA ہو یا RNA، حوالہ کی قیمت 2.5 ہے۔جب یہ 2.0 سے کم ہو تو یہ ظاہر کرتا ہے کہ چینی، نمک اور نامیاتی مادے کی آلودگی ہے۔

آر این اے کی سالمیت

RNA کی سالمیت کی پیمائش کرنا بہت ضروری ہے۔عام طور پر، یہ جانچنے کے لیے RNA ڈینیچریشن جیل کا تجربہ کرنا ضروری ہوتا ہے کہ آیا 28S اور 18S RNA کے درمیان چمک کا دو گنا تعلق ہے۔جب تیسرا بینڈ 5S ظاہر ہوتا ہے، تو اس کا مطلب ہے کہ غیر فقرے کے علاوہ، RNA کا تنزلی شروع ہو گیا ہے۔

آر این اے کے معیار کی تشخیص کے لیے ڈیٹا: مندرجہ بالا ٹیسٹوں کے علاوہ، آر این اے کی سالمیت کے حوالے سے کچھ مزید جدید آلات کے ٹیسٹ بھی ہیں، جیسے کہ ایکسپریئن آٹومیٹک الیکٹروفورسس سسٹم کا RQI انٹیگریٹی ٹیسٹ، جو یہ پتہ لگا سکتا ہے کہ آیا RNA کو پوشیدہ طور پر انحطاط کیا گیا ہے۔

سائنسی تحقیق میں، فلوروسینٹ مقداری PCR ہدف جین اور اندرونی حوالہ جین کے درمیان ایک موازنہ ہے۔لہذا، RNA نمونے کے تحفظ، RNA نکالنے، وغیرہ کے عمل میں، بنیادی مقصد RNA کی سالمیت کو یقینی بنانا ہے۔

آر این اے کی سالمیت کس طرح ہدف والے جین اور اندرونی حوالہ جین کے درمیان توازن کو متاثر کرتی ہے اسے نیچے دی گئی تصویر سے آسانی سے سمجھا جا سکتا ہے۔انحطاط جین کے نامکمل ہونے کا باعث بنے گا، چاہے یہ اندرونی حوالہ جین کا نامکمل ہونا ہو یا ٹارگٹ جین کا نامکمل ہونا، اس کا ڈیٹا پر بہت زیادہ اثر پڑے گا۔

ٹارگٹ جین اور ریفرنس جین کا اسکیمیٹک ڈایاگرام، درست نہیں ہونا چاہیے۔

روکنا ٹیسٹ (چاہے سی ٹی ویلیو کو زیادہ یا کم ارتکاز یا دیگر حالات میں دبایا گیا ہو)

اس اعداد و شمار کو مثال کے طور پر لیتے ہوئے، پانچ منحنی خطوط کی Ct قدریں درج ذیل ہیں۔منحنی خطوط کے درمیان CT قدروں کی تقسیم ناہموار ہے، اور Ct قدریں زیادہ اور کم ارتکاز کے تحت تاخیر کا شکار ہوتی ہیں، جو کہ PCR کی روک تھام کا معاملہ ہے۔

اہم نکتہ: آر این اے نکالنے کے عمل میں، ہمیں غلط فہمیوں کو ترک کرنے اور درست تصورات قائم کرنے کی ضرورت ہے۔

غلط خیال یہ ہے کہ: RNA نکالنا صرف پیداوار کا پیچھا کرتا ہے، یہ سوچ کر کہ RNA کی جتنی زیادہ مقدار حاصل کی جائے گی، اتنا ہی بہتر ہے۔درحقیقت، جب ہم مقدار کا تعین کرتے ہیں، اگر جینز کی تعداد بہت زیادہ نہیں ہے، تو ہمیں زیادہ RNA کی ضرورت نہیں ہے۔آر این اے کی مقدار جو آپ نکالتے ہیں کافی سے زیادہ ہے۔

صحیح تصور یہ ہے:آر این اے نکالنے میں پاکیزگی، سالمیت اور مستقل مزاجی ہونی چاہیے۔.پاکیزگی اس بات کو یقینی بنا سکتی ہے کہ بعد میں آنے والی ریورس ٹرانسکرپشن کو روکا نہیں جائے گا اور ڈیٹا ڈی این اے سے متاثر نہیں ہوگا۔سالمیت ہدف کی ترتیب اور اندرونی حوالوں کے توازن کو یقینی بناتی ہے۔مستقل مزاجی نمونہ کی مستحکم لوڈنگ کو یقینی بناتی ہے۔

MIQE (4) - ریورس ٹرانسکرپشن
غلط فہمی: اعلیٰ نمونے کے حجم کا حصول۔
درست تصور: مستقل مزاجی (استحکام) کی پیروی کریں، قطع نظر آر این اے کی بھری ہوئی مقدار، ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی مستقل رہتی ہے، اس بات کو یقینی بناتے ہوئے کہ cDNA میں فرق واقعی mRNA میں فرق کو ظاہر کر سکتا ہے۔
ہم اس عمل کو اسکیمیٹک ڈایاگرام کے ساتھ بیان کرتے ہیں:

ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی کا اسکیمیٹک ڈایاگرام، درست نہ ہو۔
سب سے پہلے، ہمیں ریورس ٹرانسکرپشن کے عمل اور پی سی آر کے عمل کے درمیان فرق کو سمجھنے کی ضرورت ہے۔پی سی آر متعدد حرارتی اور اینیلنگ کے عمل سے گزرتا ہے، اور ہدف کا ٹکڑا تیزی سے بڑھتا ہے۔جبکہ ریورس ٹرانسکرپشن میں یہ عمل نہیں ہوتا ہے، ہم تصور کر سکتے ہیں کہ نقل کے عمل کے دوران ریورس ٹرانسکرپشن درحقیقت ون ٹو ون ہوتا ہے، جتنے RNA کے ٹکڑے

جیسا کہ سی ڈی این اے کی معلومات کے جتنے ٹکڑے مل سکتے ہیں، اسے اب تک سمجھ لینا چاہیے، کیونکہ بڑے اور چھوٹے ٹکڑوں کو الٹا نقل کیا گیا ہے، اور ایک ٹکڑے پر توجہ مرکوز کرنا ناممکن ہے۔اور چونکہ آر این اے کی مقدار نسبتاً کم ہے، اس لیے حاصل کردہ سی ڈی این اے کی مقدار بھی نسبتاً کم ہے، پی سی آر کے برعکس، جس میں ایمپلیفیکیشن اثر ہوتا ہے، اس لیے اس کا پتہ لگانا بنیادی طور پر ناممکن ہے۔

سی ڈی این اے الیکٹروفورسس کے نتائج
دوم، مثالی طور پر، ریورس ٹرانسکرپشن ون ٹو ون کیا جاتا ہے، لیکن کسی بھی کمپنی سے کوئی ریورس ٹرانسکرپٹ اس اثر کو حاصل نہیں کر سکتا۔بنیادی طور پر، زیادہ تر ریورس ٹرانسکرپٹیس کی کارکردگی 30-50% کے درمیان گھومتی ہے۔اگر ایسا ہے تو، ہمارے پاس نسبتاً مستحکم ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی ہوگی، جو ہم تصویر میں دیکھنا چاہتے ہیں: 3 RNAs کو 2 cDNAs، 6 RNAs کو 4 cDNAs ملتے ہیں، لہذا اس سے کوئی فرق نہیں پڑتا ہے کہ کتنا ہی نمونہ لوڈ کیا گیا ہے، ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی نسبتاً مستحکم ہے۔ہم اس صورت حال کو نہیں دیکھنا چاہتے جہاں ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی غیر مستحکم ہو اور اعلی ارتکاز کو روکا ہو۔

تو، اس بات کی تصدیق کیسے کی جائے کہ آیا ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی مستحکم ہے؟طریقہ بہت آسان ہے، آپ کو صرف ایک موازنہ ٹیسٹ کرنے کی ضرورت ہے: ایک یہ ہے کہ آر این اے کو دگنا کرنے کے بعد سی ڈی این اے میں ٹرانسکرائب کریں، اور دوسرا سی ڈی این اے میں ریورس ٹرانسکرائب کرنے کے بعد دگنا کم کرنا، اور پھر حاصل شدہ ڈھلوان کو دیکھنے کے لیے کیو پی سی آر کریں کہ کیا یہ مطابقت رکھتا ہے۔ایک اعلیٰ طالب علم کے طور پر، آپ کو اسے سیکنڈوں میں سمجھ لینا چاہیے۔جیسا کہ نیچے دکھایا گیا ہے:

RNA اور cDNA کی کمزوری جانچنے کے لیے کہ آیا ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی مستحکم ہے۔
ٹرانسکرپٹیس اور کٹ کو ریورس کریں۔
فلوروسینٹ مقداری پی سی آر میں بہترین ریورس ٹرانسکرپٹیس اور کٹ کیسے ہو سکتی ہے۔ریورس ٹرانسکرپٹیس کو ماخذ کے مطابق تقریباً دو اقسام میں تقسیم کیا گیا ہے، AMV یاM-MLV، اور ان کی کارکردگی وہی ہے جو ٹیبل میں دکھائی گئی ہے۔

RNase H سرگرمی
RNase H Ribonuclease H ہے، چینی نام ribonuclease H ہے، جو کہ ایک endoribonuclease ہے جو DNA-RNA ہائبرڈ چین میں RNA کو خاص طور پر ہائیڈولائز کر سکتا ہے۔RNase H واحد پھنسے ہوئے یا ڈبل ​​پھنسے ہوئے DNA یا RNA میں فاسفوڈیسٹر بانڈز کو ہائیڈولائز نہیں کر سکتا، یعنی یہ واحد پھنسے ہوئے یا ڈبل ​​پھنسے ہوئے DNA یا RNA کو ہضم نہیں کر سکتا۔عام طور پر cDNA کے دوسرے اسٹرینڈ کی ترکیب میں استعمال ہوتا ہے۔

یہ ایک عجیب بات ہے۔ہم کہتے ہیں کہ ریورس ٹرانسکرپٹیس میں RNase H سرگرمی ہوتی ہے، یہ نہیں کہ ریورس ٹرانسکرپٹیس میں RNase H ہوتا ہے، اور RNase H کو ریورس ٹرانسکرپٹیس سے الگ کرنا ممکن نہیں ہوسکتا ہے، شاید ریورس ٹرانسکرپٹیس میں کچھ گروپس کی تشکیل کی وجہ سے یہ سرگرمی ریورس ٹرانسکرپٹیس کی وجہ سے ہوتی ہے۔

لہذا، AMV کی زیادہ ریورس ٹرانسکرپشن کارکردگی سے قطع نظر، اس کی RNase H سرگرمی cDNA کی پیداوار کو کم کرتی ہے۔بلاشبہ، ریجنٹ مینوفیکچررز اپنی مصنوعات کو مسلسل بہتر بنا رہے ہیں تاکہ ریورس ٹرانسکرپٹیس میں RNase H سرگرمی کو ختم کیا جا سکے تاکہ cDNA کی پیداوار میں اضافہ ہو سکے۔
اینیلنگ درجہ حرارت

مختلف درجہ حرارت پر RNA کی ثانوی ساخت
مختلف درجہ حرارت پر RNA کے ثانوی ڈھانچے کے لیے اوپر دیے گئے اعداد و شمار کو دیکھیں، اور مخصوص درجہ حرارت اور نمک کے ارتکاز کے حالات میں ہدف کے ٹکڑے کی ثانوی ساخت کا تعین کرنے کے لیے mFold آن لائن ٹول کا استعمال کریں۔55°C پر، RNA کا ثانوی ڈھانچہ اب بھی بہت پیچیدہ ہے، ریورس ٹرانسکرپٹیس کام نہیں کر سکتا، اور ثانوی ڈھانچہ 65°C تک مکمل طور پر حل نہیں ہو سکتا، جب کہ AMV اور M-MLV کا زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت اس درجہ حرارت سے بہت کم ہے۔
کیا کرنا ہےثانوی ڈھانچہ خود ٹیمپلیٹ کی تکمیلی جوڑی ہے، جو پرائمر اور ریورس ٹرانسکرپٹیس اور ٹیمپلیٹ کے درمیان مضبوط مسابقت کا باعث بنتا ہے، جس کے نتیجے میں مسائل کا ایک سلسلہ ہوتا ہے جیسے کہ کم E اور ناقص تکراری قابلیت۔

کیا کرنا ہےصرف اینیلنگ درجہ حرارت کو جتنا ممکن ہو بڑھائیں۔

بہت سے ریجنٹ مینوفیکچررز جینیاتی انجینئرنگ کے ذریعے اپنے ریورس ٹرانسکرپٹیس کو بہتر بنا رہے ہیں۔کچھ رد عمل کا درجہ حرارت بڑھاتے ہیں، جیسے جیفان اور ایڈلائی، اور کچھ RNase H انزائم کے فعال گروپ کو ہٹا دیتے ہیں تاکہ انزائم اور RNA ٹیمپلیٹ کے درمیان تعلق کو بہتر بنایا جا سکے۔اعلی تعلق مسابقتی طور پر ثانوی ڈھانچے کو نچوڑ سکتا ہے اور آسانی سے پڑھ سکتا ہے، اور ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی کو بھی بہت بہتر بنا سکتا ہے۔
کلیدی نکتہ: ریورس ٹرانسکرپشن ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی کی مستقل مزاجی کو حاصل کرنے کے لیے زیادہ اہم ہے (انزائمز کو نہ صرف موثر بلکہ مستحکم بھی ہونا چاہیے)، بجائے اس کے کہ بھری ہوئی نمونے کی مقدار، اگر یہ خاص طور پر بڑے پیمانے پر فلوروسینٹ مقداری PCR نہیں ہے، تو یہ بالکل ممکن نہیں ہوگا۔متعدد سی ڈی این اے۔
مختلف صنعت کاروں نے مستقل مزاجی کے حصول میں کچھ کوششیں بھی کی ہیں۔مثال کے طور پر، اب زیادہ تر کمپنیوں نے ریورس ٹرانسکرپشن کو فروخت کے لیے معیاری کٹ کے طور پر پیک کیا ہے، جو کہ ایک اچھا انتخاب ہے۔
مثال کے طور پر، Foregene's RT Easy Series کٹس:

RT ایزی I (ماسٹر پریمکس برائے فرسٹ اسٹرینڈ سی ڈی این اے ترکیب کٹ)

MIQE (5) - ہدف جین کی معلومات

مندرجہ بالا اعداد و شمار کی وضاحت کرتا ہے
1. آیا یہ جین بار بار کیے جانے والے تجربات کے لیے موثر ہے یا نہیں اس کی تصدیق عام طور پر بار بار کیے جانے والے تجربات سے کی جا سکتی ہے۔
2. جین آئی ڈی، آپ جانتے ہیں۔
3. جین کی لمبائی، ہدف جین کی کل لمبائی یقینی طور پر کوئی مسئلہ نہیں ہے.پرائمر ڈیزائن کرتے وقت، اس بات کو یقینی بنائیں کہ ایمپلی کون کی لمبائی 80-200bp کے درمیان ہو تاکہ بہتر ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کو یقینی بنایا جا سکے۔
4. سیکوینس بلاسٹ موازنہ کی معلومات، ہدف جین کا جین بینک میں موازنہ کرنے کی ضرورت ہے تاکہ غیر مخصوص امپلیفیکیشن کو روکا جا سکے۔
5. pseudogenes کی موجودگی.سیوڈوجین ایک عام جین کی طرح ایک ڈی این اے ترتیب ہے لیکن اپنا معمول کا کام کھو دیتا ہے۔یہ اکثر یوکرائٹس کے ملٹی جین فیملی میں موجود ہوتا ہے۔یہ عام طور پر ψ سے ظاہر ہوتا ہے۔یہ جینوم میں ایک غیر فعال جینومک ڈی این اے کاپی ہے جو کوڈنگ جین کی ترتیب سے بہت ملتی جلتی ہے۔، عام طور پر نقل نہیں کیا جاتا ہے، اور اس کا کوئی واضح جسمانی معنی نہیں ہوتا ہے۔
6. پرائمر کی پوزیشن exons اور introns کی نسبت۔ابتدائی سالوں میں، جب ہم نے ڈی این اے کی آلودگی کے مسئلے کو حل کیا، تو ہم نے اکثر پرائمر، ایکسونز، اور انٹرانز کی پوزیشنوں پر توجہ دی، اور عام طور پر ڈی این اے ایمپلیفیکیشن سے بچنے کے لیے پرائمر کو ڈیزائن کرنے پر غور کیا۔براہ کرم نیچے دی گئی تصویر دیکھیں: سیاہ انٹرن کی نمائندگی کرتا ہے، مختلف بلیوز ایکسونز کی نمائندگی کرتا ہے، گلابی عام پرائمر کی نمائندگی کرتا ہے، اور روشن سرخ انٹرن اسپیننگ پرائمر کی نمائندگی کرتا ہے۔

منصوبہ بندی، کبھی سچ نہیں
یہ کتنا کامل منصوبہ لگتا ہے، لیکن درحقیقت، زیادہ تر معاملات میں، ٹرانس انٹرن پرائمر اتنے جادوئی نہیں ہوتے جتنے تصور کیے جاتے ہیں، اور وہ غیر مخصوص امپلیفیکیشن کا سبب بھی بنتے ہیں۔لہذا ڈی این اے کی آلودگی کو روکنے کا بہترین طریقہ ڈی این اے کو مکمل طور پر ہٹانا ہے۔
7. تشکیل کی پیشن گوئی۔اس مثال کو دوبارہ استعمال کرتے ہوئے، مخصوص درجہ حرارت اور نمک کے ارتکاز پر ہدف کے ٹکڑے کی ثانوی ساخت کا تعین کرنے کے لیے mFold آن لائن ٹول کا استعمال کریں۔

مختلف درجہ حرارت پر RNA کی ثانوی ساخت
ثانوی ڈھانچہ خود ٹیمپلیٹ کی تکمیلی جوڑی ہے، جو پرائمر اور ٹیمپلیٹ کی جوڑی کے درمیان مضبوط مسابقت کا باعث بنے گی، اور پرائمر بائنڈنگ کے امکانات کم ہیں، جس کے نتیجے میں مسائل کا ایک سلسلہ ہے جیسے کہ کم E اور خراب ریپیٹ ایبلٹی۔سافٹ ویئر کی پیشن گوئی کے ذریعے، اگر کوئی ثانوی ساخت کا مسئلہ نہیں ہے، تو یہ بہت اچھا ہوگا۔اگر موجود ہے تو، ہمارا فالو اپ مضمون خاص طور پر اس مسئلے کو حل کرنے کے طریقہ پر بحث کرے گا۔

MIQE (6)-qPCR اولیگونوکلیوٹائڈس

فلوروسینٹ مقداری PCR کے لیے، پہلی چیز جس کے ساتھ آپ ہر روز جدوجہد کرتے ہیں وہ ہے RNA نکالنا، اور دوسری چیز پرائمر ڈیزائن ہو سکتی ہے۔
سب سے پہلے، ہم اب بھی MIQE چیک لسٹ کے مطابق پرائمر ڈیزائن کے بارے میں قواعد کو چیک کرتے ہیں۔یہ اتنا آسان ہے کہ بدمعاش ہنس سکتے ہیں، اور ہم اسے ایک جملے میں ختم کر سکتے ہیں: پرائمر پروب کی ترتیب اور پوزیشن اور ترمیم کا طریقہ معلوم کریں۔پرائمر پیوریفیکیشن کے طریقہ کار کے لیے، پرائمر کی ترکیب اس وقت بہت سستی ہے، کیو پی سی آر PAGE اور اس سے اوپر کے صاف کرنے کے طریقوں کے لائق ہے، اور ترکیب کے آلے کی معلومات اہم نہیں ہے۔بہت سے لوگ کئی دہائیوں سے پرائمر کر رہے ہیں اور یہ نہیں جانتے کہ سنتھیسائزر ABI3900 ہے۔
پرائمر ڈیزائن کے اصولوں کے بارے میں، آپ کو انہیں روٹ کے ذریعے یاد کرنے کی ضرورت نہیں ہے، کیونکہ زیادہ تر پرائمر ڈیزائن سافٹ ویئر یا آن لائن ٹولز ان مسائل کا خیال رکھ سکتے ہیں (تجویز کردہ آن لائن ٹول primer3.ut.ee/)، اور 99.999% پرائمر ڈیزائن دستی طور پر نہیں کیا جاتا ہے، دیکھو، مصنف بعض اوقات روزانہ سینکڑوں پرائمر ڈیزائن کرتا ہے، اگر آپ اسے ایک ایک کر کے پڑھتے ہیں، تو یہ ہو جائے گا۔
پرائمر ڈیزائن کرنے کے بعد صرف مندرجہ ذیل نکات کو چیک کریں:
1. پرائمر 3′ سرے کے قریب ڈیزائن کریں: cDNA فرسٹ اسٹرینڈ کی ترکیب کے لیے oligo dT پرائمر استعمال کرنے کی صورت میں، ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی اور RNA کی سالمیت کو مدنظر رکھتے ہوئے، ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کو بہتر بنانے کے لیے ڈیزائن کیے گئے پرائمرز کو 3′ سرے کے قریب ڈیزائن کرنے کی ضرورت ہے۔مندرجہ ذیل وضاحت کے لیے تصویر کا استعمال کریں (اس کو سمجھنے کا کوئی طریقہ نہیں ہے):

پرائمر کو 3′ سرے کے قریب کیوں ڈیزائن کیا جانا چاہیے، یہ درست نہیں ہونا چاہیے۔
2. TM قدر: Tm قدر 55-65°C پر ہے (کیونکہ exonuclease سرگرمی 60°C پر سب سے زیادہ ہے)، اور GC کا مواد 40%-60% ہے۔
3. BLAST: جینوم کی غیر مخصوص توسیع سے بچنے کے لیے، بلاسٹ کو اضافی تصدیق کے لیے استعمال کیا جانا چاہیے۔

MIQE(7)-qPCR عمل

1. کیو پی سی آر کٹ
MIQE کے تقاضوں کے مطابق، ہمیں آرٹیکل میں مکمل رد عمل کی شرائط کو واضح طور پر بیان کرنا چاہیے، بشمول PCR ری ایکشن سسٹم کی ترتیب، کون سی کٹ استعمال کی جاتی ہے، مینوفیکچرر کون ہے، ری ایکشن سسٹم کتنا بڑا ہے، آیا ڈائی کا طریقہ یا تحقیقات کا طریقہ استعمال کیا جاتا ہے، PCR پروگرام کی سیٹنگز۔تجربہ کار ڈرائیوروں کو یقینی طور پر معلوم ہوگا کہ جب تک کٹ کا انتخاب کیا جاتا ہے، اوپر کی معلومات بنیادی طور پر طے کی جاتی ہیں۔
اس وقت فلوروسینٹ مقداری PCR کٹس کی تیاری اور پیداوار ایک بہت ہی پختہ ٹیکنالوجی ہے۔جب تک آپ انتہائی خراب مینوفیکچررز کا انتخاب نہیں کرتے ہیں، مسائل کا امکان زیادہ نہیں ہے، لیکن پھر بھی ہم آپ کے ساتھ چند نکات کا اشتراک کرنا چاہتے ہیں:
ہاٹ اسٹارٹ ٹاک انزائم:پی سی آر کا سب سے اہم حصہ ہاٹ اسٹارٹ ٹاک انزائم ہے۔مارکیٹ میں موجود ہاٹ سٹارٹ انزائمز کو عام طور پر دو اقسام میں تقسیم کیا جاتا ہے، ایک کیمیائی طور پر تبدیل شدہ ہاٹ سٹارٹ انزائم ہے (آپ اسے پیرافین ایمبیڈنگ کے طور پر تصور کر سکتے ہیں)، اور دوسرا اینٹی باڈی میں ترمیم کے لیے ہاٹ سٹارٹ انزائم ہے (اینٹیجن اینٹی باڈی بائنڈنگ)۔کیمیائی ترمیم گرم شروع ہونے والے خامروں کا ابتدائی طریقہ ہے۔جب ایک خاص درجہ حرارت تک پہنچ جاتا ہے، انزائم اپنی سرگرمی جاری کرے گا.اینٹی باڈی میں ترمیم شدہ ہاٹ اسٹارٹ انزائم انزائم کی سرگرمی کو روکنے کے لیے حیاتیاتی طریقوں کا استعمال کرتا ہے۔جب ایک خاص درجہ حرارت تک پہنچ جاتا ہے تو، اینٹی باڈی کو غیر فعال کر دیا جائے گا اور پروٹین کے طور پر غیر فعال ہو جائے گا، اور انزائم کی سرگرمی کو عمل میں لایا جائے گا۔

تاہم، اس کا کیا فائدہ؟یہ معاملہ ہے، اینٹی باڈی میں ترمیم شدہ خامروں کی رہائی کی سرگرمی کیمیائی طور پر تبدیل شدہ خامروں کی نسبت زیادہ تیز ہوتی ہے، اس لیے حساسیت کے لحاظ سے، اینٹی باڈی میں ترمیم شدہ خامروں کا تھوڑا سا فائدہ ہوتا ہے، تاکہ مارکیٹ میں موجود کٹس میں بنیادی طور پر کوئی کیمیائی طور پر تبدیل شدہ انزائمز موجود نہ ہوں۔اگر ہے، تو یہ صنعت کار کی ٹیکنالوجی ابھی تک ہزار سالہ دور میں پھنسی ہوئی ہے۔
میگنیشیم آئن کا ارتکاز:پی سی آر کے رد عمل میں میگنیشیم آئن کا ارتکاز بہت اہم ہے۔مناسب میگنیشیم آئن کا ارتکاز Taq انزائم کی سرگرمی کو فروغ دے سکتا ہے۔اگر ارتکاز بہت کم ہے تو، انزائم کی سرگرمی نمایاں طور پر کم ہو جائے گی؛اگر ارتکاز بہت زیادہ ہے تو، انزائم کیٹلیزڈ غیر مخصوص امپلیفیکیشن کو بڑھایا جائے گا۔میگنیشیم آئنوں کا ارتکاز پرائمر کی اینیلنگ، ٹیمپلیٹ کے پگھلنے والے درجہ حرارت اور پی سی آر مصنوعات کو بھی متاثر کرے گا، اس طرح بڑھے ہوئے ٹکڑوں کی پیداوار کو متاثر کرے گا۔میگنیشیم آئنوں کا ارتکاز عام طور پر 25mM پر کنٹرول کیا جاتا ہے۔بلاشبہ، ایک اچھی کٹ کے لیے، میگنیشیم آئنوں کے ارتکاز کو اچھی طرح سے کنٹرول کرنا ضروری ہے۔کچھ تاجر ری ایجنٹ میں میگنیشیم آئن چیلیٹنگ ایجنٹ شامل کرتے ہیں، جو میگنیشیم آئن کے ارتکاز کی خودکار ایڈجسٹمنٹ کا اثر حاصل کر سکتا ہے۔
فلوروسینٹ ڈائی حراستی:فلوروسینٹ ڈائی، جو کہ ایس وائی بی آر گرین ہے جسے ہم عام طور پر استعمال کرتے ہیں، بنیادی طور پر ڈبل سٹرینڈڈ ڈی این اے کی معمولی نالی سے منسلک ہو کر فلوروسینس پیدا کرتا ہے، کیونکہ ڈائی کا ڈبل ​​سٹرینڈ ڈی این اے سے منسلک ہونا غیر مخصوص ہے، یعنی جب تک ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے، یہ ڈی این اے کے ساتھ مل کر فلو سٹرینڈ ہو سکتا ہے اور پرائمر ڈی این اے کے ساتھ مل سکتا ہے۔ سسٹم اس کے ساتھ مل کر بیک گراؤنڈ سگنل بنائے گا۔
PS: اس کی روشنی سے متعلق حساس خصوصیات کی وجہ سے، مارکیٹ میں موجود مصنوعات کو عام طور پر بھوری مبہم سینٹری فیوج ٹیوبوں میں پیک کیا جاتا ہے (جیسا کہ نیچے تصویر میں دکھایا گیا ہے)۔تاہم، یہ ایک مسئلہ کا سامنا کرے گا.یہ دیکھنا مشکل ہے کہ آیا سیمپلنگ کرتے وقت مائع چوسا جاتا ہے۔اس سلسلے میں، Qingke درحقیقت سب سے زیادہ صارف دوست ہے (جیسا کہ نیچے تصویر میں دکھایا گیا ہے)، اور شفاف ٹیوب کو ایک مبہم ٹن بیگ میں پیک کیا گیا ہے۔پھر روشنی سے بچنے اور نمونے لینے کی سہولت کو مدنظر رکھتے ہوئے اسے ٹن کے تھیلے میں ڈال دیں۔آپ کو صحیح پروڈکٹ نمبر کا انتخاب کرنا چاہیے۔TSE204 ایک انتہائی سرمایہ کاری مؤثر وجود ہے، جس کی وجہ سے میں گھاس لگانا چاہتا ہوں۔

فلوروسینٹ ڈائی کا ارتکاز بھی بہت اہم ہے۔اگر ارتکاز بہت کم ہے تو، بعد کے مرحلے میں ایمپلیفیکیشن وکر اوپر نہیں جائے گا اور کامل نہیں ہوگا۔اگر ارتکاز بہت زیادہ ہے، تو یہ شور کی مداخلت کا سبب بنے گا۔چونکہ فلوروسینٹ مقداری PCR بنیادی طور پر CT قدر پر منحصر ہوتا ہے، اگر فلوروسینٹ ڈائی کے ارتکاز کو مناسب طریقے سے ایڈجسٹ نہیں کیا جاتا ہے، تو کم پوائنٹ ہائی پوائنٹ سے بہتر ہے۔بلاشبہ، مناسب ڈائی ارتکاز بہترین ہے۔

ROX: ROX رنگوں کو اچھی طرح سے فلوروسینس سگنل کی غلطیوں کو درست کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔کچھ سازوسامان بنانے والوں کو انشانکن کی ضرورت ہوتی ہے، جبکہ دیگر نہیں کرتے۔مثال کے طور پر، تھرمو فشر سائنٹیفک کے ریئل ٹائم پی سی آر ایمپلیفیکیشن انسٹرومنٹ کے استعمال کے لیے عام طور پر کیلیبریشن کی ضرورت ہوتی ہے، بشمول 7300، 7500، 7500Fast، StepOnePlus، وغیرہ۔ عام کٹ ہدایات اس کی وضاحت کریں گی۔
Foregene کے qPCR مکس میں ROX ڈائی بھی شامل ہے، جو مختلف ماڈلز میں استعمال کے لیے آسان ہے۔

ریئل ٹائم پی سی آر کٹ-تقمان

کمزور ہائیڈروجن بانڈ کا علاج: کمزور ہائیڈروجن بانڈز کا علاج نسبتاً تکنیکی معاملہ ہے۔کسی بھی چیز نے بہت سی کٹس کے دستورالعمل کو نہیں پڑھا، لیکن ان میں سے کسی نے بھی اس موضوع کا ذکر نہیں کیا۔اصل میں، یہ بہت اہم ہے.اڈوں کا مجموعہ بنیادی طور پر ہائیڈروجن بانڈز کی طاقت پر منحصر ہے۔مضبوط ہائیڈروجن بانڈز نارمل ایمپلیفیکیشن ہیں، اور کمزور ہائیڈروجن بانڈ غیر مخصوص امپلیفیکیشن کا باعث بنتے ہیں۔اگر کمزور ہائیڈروجن بانڈز کو اچھی طرح سے ختم نہیں کیا جا سکتا، تو غیر مخصوص امپلیفیکیشن سے گریز نہیں کیا جا سکتا۔مصنف کے دائرہ کار میں، صرف چند کمپنیوں نے اس مسئلے کو دیکھا ہے۔جب آپ کٹ خریدتے ہیں، تو آپ اس بات کا حوالہ دے سکتے ہیں کہ آیا آپ نے جس کٹ کا انتخاب کرنا چاہتے ہیں اس کے لیے آپ نے اس سلسلے میں کسی حل پر غور کیا ہے۔

رد عمل کا حجم: 20-50ul سسٹم زیادہ عام طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور چھوٹے حجم میں غلطیوں کا امکان ہوتا ہے۔عام طور پر، کٹ ہدایات پی سی آر رد عمل والیوم کے استعمال کی سفارش کرے گی۔ہوشیار نہ بنیں اور اخراجات بچانے کے لیے چھوٹی مقداریں استعمال کریں۔کا مقصد.تاجروں کی طرف سے تجویز کردہ حجم کی حقیقت میں جانچ کی گئی ہے، اور یہ ہو سکتا ہے کہ وہ چھوٹے حجم کی وجہ سے ہونے والی غلطیوں کا مسئلہ حل نہ کر سکیں۔
2. ٹیوب پلیٹ کا مینوفیکچرر اور آرٹیکل نمبر
فلوروسینٹ مقداری پی سی آر کے اصول کو ہر کوئی جانتا ہے۔فلوروسینس جمع کرنا بنیادی طور پر پی سی آر ٹیوب کیپس کے ذریعے کیا جاتا ہے۔پی سی آر استعمال کی اشیاء کا انتخاب کرتے وقت، دو نکات پر توجہ دیں: اچھی روشنی کی ترسیل اور آلہ کے لیے موزوں۔عام طور پر، مین اسٹریم برانڈز کے بورڈز اور ٹیوبز ٹھیک ہیں، لیکن آپ کو موافقت کے لحاظ سے احتیاط سے انتخاب کرنا ہوگا، ورنہ آپ اس آلے کو استعمال نہیں کر پائیں گے۔

4. اعلی درجے کا علم

MIQE (8)-qPCR کی توثیق
یہ qPCR کی اولین ترجیح ہے!یہاں بہت سے ہیرو ریت میں گر چکے ہیں۔بلاشبہ، یہ بھی ممکن ہے کہ آپ خوش قسمت ہوں اور جن جینز کا آپ نے مطالعہ کیا وہ سادہ ہیں، اس لیے آپ برف کے غار میں ہوا کے ساتھ تیر گئے۔کیو پی سی آر کی تصدیقی معلومات کا مقصد ڈیٹا کی وشوسنییتا کو جانچنا ہے۔ہم مندرجہ ذیل ضروری تصدیقی معلومات درج کرتے ہیں:

1.Specificity ٹیسٹ
ٹارگٹ جین ایمپلیفیکیشن کی خصوصیت کو یہ جانچ کر جانچا جاتا ہے کہ آیا الیکٹروفورسس تصویر ایک ہی بینڈ ہے؛ترتیب کی توثیق؛پگھلنے والا وکر یہ دیکھنے کے لیے کہ آیا چوٹی کا نقشہ سنگل ہے۔ینجائم عمل انہضام کی توثیق اور دیگر طریقوں.
یہاں، ہم ٹی پر توجہ مرکوز کرتے ہیںوہ پگھلنے کے منحنی خطوط کا استعمال کرتے ہوئے غیر مخصوص امپلیفیکیشن کا تجزیہ کرتا ہے۔.عام طور پر، جب ہم پرائمر ڈیزائن کرتے ہیں، تو پروڈکٹ کے ٹکڑے کا سائز 80-200bp کی حد میں ہونا ضروری ہے، جو PCR پروڈکٹ کے پگھلنے کا درجہ حرارت 80-85 °C کی حد میں بناتا ہے۔لہٰذا، اگر متفرق چوٹیاں ہیں، تو دیگر غیر مخصوص امپلیفیکیشن مصنوعات بھی ہونی چاہئیں۔اگر چوٹی 80 ° C سے نیچے ظاہر ہوتی ہے، تو اسے عام طور پر پرائمر ڈائمر سمجھا جاتا ہے۔اگر چوٹی 85 ° C سے اوپر ظاہر ہوتی ہے، تو اسے عام طور پر DNA آلودگی یا بڑے ٹکڑوں کی غیر مخصوص پرورش سمجھا جاتا ہے۔
نوٹ: بعض اوقات 80 ° C پر صرف ایک چوٹی ہوتی ہے۔اس وقت، اس تصور پر عمل کرنا ضروری ہے.یہ امکان ہے کہ پروردن کے نتائج تمام پرائمر ڈائمر ہیں۔

عام پگھلنے کا منحنی خطوط (ایک چوٹی بغیر کسی غیر مخصوص پروردن کے)

مسئلہ پگھلنے کا منحنی خطوط (جعلی چوٹیوں کا غیر مخصوص اضافہ)
【کیس کا تجزیہ】

ایک اہم چوٹی ہے، لیکن پرائمر ڈائمر سنجیدہ ہے۔
نیچے دیے گئے اعداد و شمار میں سنگل چوٹی پگھلنے والا وکر آسانی سے آپ کی آنکھوں کو دھوکہ دے سکتا ہے، یہ سوچ کر کہ یہ ایک بہترین تجربہ ہے، لیکن نتیجہ بالکل غلط ہے۔اس وقت، ہمیں پگھلنے کے درجہ حرارت کو دیکھنا ہوگا۔چوٹی کا درجہ حرارت 80 ° C سے کم ہے، جو مکمل طور پر پرائمر ڈائمر ہے۔

کوئی ہدف کا ٹکڑا نہیں، تمام پرائمر ڈائمرز
یہاں، میرا بھائی نہیں روک سکتا.نیچے دی گئی تصویر ایک موبائل فون کے ساتھ لی گئی تصویر ہے جو مجھے ایک بدمعاش نے بھیجی تھی۔اس نے جو ری ایجنٹس استعمال کیے وہ سب صنعت میں عام طور پر استعمال ہونے والے برانڈز ہیں۔وہ ایک T-prefix برانڈ سے دوسرے T-prefix برانڈ میں تبدیل ہوا۔مجھے لگتا ہے کہ آپ نے پہلے ہی اس کا اندازہ لگا لیا ہے۔بدمعاش نے مجھے پکارا: "پہلی تصویر میں استعمال ہونے والا ریجنٹ بہت اچھا ہے، اور چوٹی سنگل ہے۔بعد میں، آپ کے تجویز کردہ ری ایجنٹ کو استعمال کرنے کے بعد، یہ مخلوط چوٹیوں کے ساتھ دوسری تصویر کی طرح ہو جاتا ہے۔تم نے مجھے دکھی کر دیا ہے۔"
دونوں گراف کو الگ کریں۔پہلی نظر میں، ایک کی ایک چوٹی ہے، اور دوسری میں ڈبل چوٹی ہے۔بکواس، ایک چوٹی بالکل ٹھیک ہے.کیا یہ سچ ہے؟
Dou E سے بھی بدتر، اگر میں نیچے والی تصویر میں دو تصویریں رکھوں تو آپ کو فوراً سمجھ آ جائے گی۔درحقیقت اس قسم کی تصویر سے ہم آسانی سے مفلوج ہو جاتے ہیں۔محتاط تجزیہ کے بعد، ہم نے پایا کہ: پہلے اعداد و شمار کی چوٹی 75 ° C پر ہے، جو مکمل طور پر پرائمر ڈائمر ہے۔دوسرے اعداد و شمار کی چوٹی 75 ° C اور 82 ° C پر ظاہر ہوتی ہے، کم از کم وہاں مصنوعات ظاہر ہوتی ہیں۔

طلباء کے تاثرات کی تصاویر
لہذا بنیادی مسئلہ ری ایجنٹس کا مسئلہ نہیں بلکہ پرائمر ڈیزائن کا مسئلہ ہے۔ایک ہی وقت میں، یہ بھی ثابت ہوتا ہے کہ کچھ بڑے برانڈز لوہے کے معیار کے نہیں ہیں، اور یہ بھی ثابت کرتا ہے کہ میرے بھائی نے پہلے کیا کہا: یہ ریجنٹ برانڈ نہیں ہے جو آپ کے مضمون کی حمایت کرتا ہے۔یہ آپ کا مضمون ہے جس نے ری ایجنٹس کا برانڈ تیار کیا۔ذرا تصور کریں، اگر اس بدمعاش نے ری ایجنٹس کو تبدیل نہ کیا تو جریدے کو غلط ڈیٹا بھیجا جائے گا، اور جو ہوگا وہ ایک المیہ ہوگا۔
2. خالی کنٹرول کی Ct قدر
وضاحت نہ کریں، اگر خالی کنٹرول میں Ct ویلیو ہے تو کیا یہ آلودگی نہیں ہے؟تاہم، آپ کو اب بھی یہ سمجھنے کی ضرورت ہے کہ کون سے خالی کنٹرول کی Ct قدر ہے۔اگر یہ این ٹی سی ہے، تو اس کا مطلب ہے کہ غیر ملکی ڈی این اے ہے جیسے ریجنٹ آلودگی۔اگر یہ NRT ہے تو اس کا مطلب ہے کہ نکالے گئے RNA میں DNA آلودگی ہے۔
3. معیاری وکر
ڈھلوان اور حساب کے فارمولے سمیت، PCR کی کارکردگی کو فارمولے کے ذریعے شمار کیا جا سکتا ہے۔ایک کامل تجربے کے لیے 3.32 تک پہنچنے کے لیے معیاری وکر کی ڈھلوان اور 0.9999 تک پہنچنے کے لیے R² کی ضرورت ہوتی ہے۔
4. لکیری متحرک حد
رد عمل کی متحرک حد لکیری ہے۔معیاری منحنی خطوط پیدا کرنے کے لیے استعمال ہونے والے ٹیمپلیٹ کے مطابق، متحرک رینج میں کم از کم 5 ارتکاز میلان شامل ہونا چاہیے، اور اعلی ارتکاز کے میلان اور کم ارتکاز کے میلان پر Ct قدروں کی تبدیلی پر توجہ دینا چاہیے۔
5. پتہ لگانے کی درستگی
کیو پی سی آر کے نتائج میں تبدیلیاں، یعنی ناقص ریپیٹیبلٹی، یعنی ناقص درستگی، درجہ حرارت، ارتکاز اور آپریشن سمیت کئی عوامل کی وجہ سے ہوتی ہے۔qPCR کی درستگی عام طور پر کم قابل کنٹرول ہو جاتی ہے کیونکہ کاپی نمبر کم ہوتا ہے۔مثالی طور پر تجرباتی تغیرات کے اندر، یہ تکنیکی تغیر حیاتیاتی تغیر سے الگ ہونا چاہیے، اور حیاتیاتی نقلیں گروپوں یا علاج کے درمیان qPCR کے نتائج میں شماریاتی فرق کو براہ راست حل کر سکتی ہیں۔خاص طور پر تشخیصی اسیسز کے لیے، تمام سائٹس اور آپریٹرز کے درمیان بہترین انٹر-اسے درستگی (دوہرائی جانے کی صلاحیت) کی اطلاع دی جانی چاہیے۔
6. پتہ لگانے کی کارکردگی اور LOD (ملٹی پلیکس کیو پی سی آر میں)
LOD 95% مثبت نمونوں کا سب سے کم ارتکاز ہے۔دوسرے الفاظ میں، ٹارگٹ جین ریپلیکیٹس کے ایک سیٹ کے اندر موجود LOD کا ارتکاز ناکام ہونے والے رد عمل کے 5% سے زیادہ نہیں ہونا چاہیے۔ملٹی پل کیو پی سی آر تجزیہ کرتے وقت، خاص طور پر پوائنٹ میوٹیشن یا پولیمورفیزم کی بیک وقت پتہ لگانے کے لیے، ملٹی پلیکس کیو پی سی آر کو اس بات کا ثبوت فراہم کرنے کی ضرورت ہوتی ہے کہ ایک ہی ٹیوب میں ایک سے زیادہ ٹارگٹ فریگمنٹس کی درستگی پر سمجھوتہ نہیں کیا گیا ہے، ایک سے زیادہ پتہ لگانے اور سنگل ٹیوب کا پتہ لگانے کی کارکردگی اور LOD ایک جیسی ہونی چاہیے۔خاص طور پر جب زیادہ ارتکاز والے ہدف کے جینز اور کم ارتکاز والے ہدف کے جینز کو بیک وقت بڑھایا جاتا ہے، تو اس مسئلے پر توجہ دی جانی چاہیے۔
مسائل اور حلعام طور پر، کیو پی سی آر ڈیبگنگ میں جن مسائل کا اکثر سامنا ہوتا ہے وہ درج ذیل پہلوؤں پر توجہ مرکوز کرتے ہیں:
· غیر مخصوص پروردن
· پرائمر کی حراستی کا مشکل انتخاب اور پرائمر ڈائمرز کے ساتھ پریشانی
· اینیلنگ کا درجہ حرارت غلط ہے۔
ثانوی ڈھانچہ امپلیفیکیشن کی کارکردگی کو متاثر کرتا ہے۔
غیر مخصوص پروردن
غیر مخصوص پروردنہوتا ہے، عام طور پر اس بات پر غور کیا جاتا ہے کہ آیا پرائمر ڈیزائن مناسب نہیں ہے، لیکن اگر آپ کو پرائمر تبدیل کرنے کی جلدی نہیں ہے، تو آپ پہلے درج ذیل طریقے آزما سکتے ہیں (اصول بھی منسلک ہے):
اینیلنگ درجہ حرارت میں اضافہ کریں - کمزور ہائیڈروجن بانڈز کو برقرار رکھنے کے قابل بنانے کی کوشش کریں؛
اینیلنگ اور لمبا وقت کو کم کریں - کمزور ہائیڈروجن بانڈز کے امکانات کو کم کریں؛
· پرائمر کی حراستی کو کم کریں - بے کار پرائمر اور غیر ہدف والے علاقوں کے پابند ہونے کے امکانات کو کم کریں۔
کم امپلیفیکیشن کی کارکردگی
غیر مخصوص ایمپلیفیکیشن کے برعکس صورتحال - کم ایمپلیفیکیشن ایفیشنسی، اور کم ایمپلیفیکیشن ایفیشنسی سے نمٹنے کے اقدامات بالکل برعکس ہیں:
اینیلنگ اور لمبا وقت کو طول دیں؛
· تین قدمی پی سی آر میں تبدیل کریں اور اینیلنگ درجہ حرارت کو کم کریں۔
· پرائمر کی حراستی میں اضافہ؛
Ps: 90 کی دہائی میں پیدا ہونے والے بہت سے گریجویٹ طلباء اس بات کا مطالعہ کرنے کو تیار نہیں ہیں کہ تجربات کو کیسے ڈیبگ کیا جائے، اور امید ہے کہ کٹ اس مسئلے کو مکمل طور پر حل کر سکتی ہے (اگر آپ گریجویشن کے بعد ریسرچ اور ڈویلپمنٹ کے لیے کسی ریجنٹ کمپنی میں جانا چاہتے ہیں)، درحقیقت، ریجنٹ بنانے والے بھی اس طرح سوچتے ہیں، مجھے امید ہے کہ یہ ایک احمقانہ بات ہے جب آپ اسے حاصل کریں گے، لہذا مینوفیکچررز کے مسائل کو حل کرنے کے لیے بہت ساری کوششیں ہوں گی۔ کمزور ایچ بانڈ جذب کرنے والے عوامل کا تعارف۔اس مسئلے کو آسانی سے حل کرنے کے لیے، احمقوں کو اب بھی ری ایجنٹ کمپنی کا تعارف پڑھنا پڑتا ہے تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا کوئی ایسا عنصر موجود ہے جو کمزور ہائیڈروجن بانڈز کو جذب کرتا ہے۔
پرائمر کی حراستی کا مشکل انتخاب اور پرائمر ڈائمرز کے ساتھ پریشانی
طریقہ 1: عام طور پر، qPCR کے لیے کٹ ہدایات میں سسٹمز اور تجویز کردہ پرائمر ارتکاز کی سفارش کی گئی ہے۔
طریقہ 2: پرائمر کنسنٹریشن گریڈینٹ سیٹ کرکے ڈیبگ کرنا۔ذیل کی تصویر کو واضح کرنے کے لیے ایک کمپنی سے چوری کیا گیا ہے۔ذیل کی تصویر تین پرائمر کنسنٹریشن گریڈینٹ (100nM, 250nM, 500nM) اور چار ٹیمپلیٹ کنسنٹریشن گریڈینٹ (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) کے ساتھ بنائے گئے فلوروسینس مقداری نتائج کو ظاہر کرتی ہے۔تجرباتی نتائج کی Ct قدر مندرجہ ذیل ہے:

پرائمر ارتکاز کا انتخاب ہر پرائمر حراستی کو مندرجہ ذیل لائن میں جوڑیں:

پرائمر ارتکاز کا انتخاب واضح ہے، 100nM اور 250nM کے پرائمر ارتکاز کا لکیری تعلق بہتر ہے، اور 500nM کے پرائمر ارتکاز کا لکیری تعلق نسبتاً خراب ہے۔100nM اور 250nM میں، 250nM کی Ct قدر نسبتاً چھوٹی ہے، اس لیے بہترین پرائمر ارتکاز 250nM ہے۔عام طور پر شدید پرائمر-ڈائمرز پگھلنے والے وکر میں دیکھے جا سکتے ہیں۔کیا ہوگا اگر ڈیزائن کردہ پرائمر پرائمر ڈائمرز سے بچ نہیں سکتے؟
طریقہ 3: پرائمر کی مقدار کو کم کریں اور اینیلنگ درجہ حرارت میں اضافہ کریں (وضاحت کی ضرورت نہیں)۔
اینیلنگ درجہ حرارت کی تجرباتی قدر 60 ° C ہے۔اگر آپ اس بات کا یقین نہیں کر رہے ہیں تو، زیادہ مناسب اینیلنگ درجہ حرارت کا انتخاب کیسے کریں؟جواب وہی ہے جو پرائمر کی حراستی کا انتخاب ہے -تدریجی ٹیسٹ.مسئلہ کو واضح کرنے کے لیے Bio-rad کمپنی سے تصویر لیں۔ایک مخصوص ہدف کے ٹکڑے کو بڑھاوا دینے کے لیے، درجہ حرارت کے آٹھ میلان مقرر کریں، ہر ایک تین تکرار کے ساتھ، اور حاصل کردہ امپلیفیکیشن وکر مندرجہ ذیل ہے:

اینیلنگ درجہ حرارت کا انتخاب:
· 70°C, 69°C—بنیادی طور پر، پرائمر کو یکجا نہیں کیا جا سکتا، اس لیے کوئی پرورش نہیں ہے۔
· 67.3°C - شروع میں تھوڑی مقدار میں اضافہ ہوتا ہے، اور Ct قدر نسبتاً بڑی ہوتی ہے۔
· 64.5°C——Ct قدر کم ہو جاتی ہے۔
· 60.7°C، 58.0°C، 56.2°C، اور 55.0°C پر، Ct کی قدریں بنیادی طور پر مستحکم تھیں، لیکن حتمی فلوروسینس قدریں مختلف تھیں۔
کس طرح منتخب کرنے کے لئے؟اصول: پہلا اصول اعلی Ct قدر ہے۔اسی Ct قدر کے لیے، dimerization اور غیر مخصوص امپلیفیکیشن سے بچنے کے لیے ایک اعلی اینیلنگ درجہ حرارت کا انتخاب کریں۔اگرچہ 55 ° C پر فلوروسینس قدر زیادہ ہے، اس میں ڈائمر یا غیر مخصوص امپلیفیکیشن ہو سکتا ہے۔
لیکن اگر آپ اتنے ہی ہوشیار ہیں، تو آپ یقیناً سوچیں گے: منطقی طور پر، اگر پی سی آر کا رد عمل بہت مخصوص ہے، جب تک کہ پرائمر کا ارتکاز کم از کم ضرورت سے زیادہ ہو، فلوروسینٹ رنگوں اور ڈی این ٹی پیز کی طرح، اونچے اور کم پوائنٹس کا کوئی اثر نہیں ہونا چاہیے۔درحقیقت، جب تک اینیلنگ درجہ حرارت کو مناسب طریقے سے بہتر بنایا جاتا ہے، Ct قدر پر پرائمر ارتکاز کا اثر قدرتی طور پر کم ہو جائے گا۔

اینیلنگ کے درجہ حرارت کو مناسب طریقے سے بہتر بنایا گیا ہے، اور CT پر پرائمر کے ارتکاز کے اثر کو کم کیا جائے گا۔
ثانوی ڈھانچہ پروردن کی کارکردگی کو متاثر کرتا ہے۔
آئیے مسئلے کو واضح کرنے کے لیے Bio-rad سے تصویر لیتے ہیں۔یہ ثانوی ساخت کے ساتھ جین کو بڑھانے کے لیے درجہ حرارت کا میلان بھی ڈیزائن کرتا ہے۔

ثانوی ڈھانچہ ابھرتا ہے۔
یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ جیسے جیسے درجہ حرارت کا میلان کم ہوتا ہے، مصنوعات ظاہر ہونا شروع ہو جاتی ہیں اور Ct قدر آگے بڑھتی ہے، کم از کم قدر 60.7 ° C پر پہنچ جاتی ہے، اور پھر جیسے جیسے درجہ حرارت کا میلان کم ہوتا ہے، Ct قدر بڑی ہو جاتی ہے۔اس کے برعکس، جیسے جیسے درجہ حرارت بڑھتا ہے، ثانوی ڈھانچہ کھل جاتا ہے اور امپلیفیکیشن کی کارکردگی میں اضافہ ہوتا ہے۔ایک خاص درجہ حرارت تک پہنچنے کے بعد، درجہ حرارت میں اضافہ امپلیفیکیشن کی کارکردگی کو بہتر نہیں بنا سکتا۔کیونکہ اس وقت پرائمر کو مستحکم طور پر جوڑا نہیں جا سکتا۔لہذا،سب سے کم Ct قدر کے ساتھ درجہ حرارت تلاش کریں۔، جو ثانوی ساخت کے سانچے کو بڑھانے کے لیے بہترین درجہ حرارت ہے!بلاشبہ، ہوشیار احمقوں کو معلوم ہونا چاہیے کہ اگر یہ ضروری نہیں ہے تو، پرائمر کو تبدیل کرنا اور ثانوی ساخت کے علاقے سے بچنا بہتر ہے۔
5. درخواست کی سطح
MIQE - ڈیٹا تجزیہ

ڈیٹا کا تجزیہ بنیادی طور پر فلوروسینٹ مقداری پی سی آر آلے کے ذریعہ دیا جاتا ہے۔پچھلے مضمون میں، ڈیٹا کے تجزیہ کا بہت کام کیا گیا ہے، جیسا کہ خالی کنٹرول، جس کی وضاحت تجربے کے ڈیزائن میں کی گئی ہے۔اندرونی حوالہ جینز، ریپیٹ نمبرز وغیرہ کو واضح کیا گیا ہے۔، یہاں ہم بنیادی طور پر qPCR کے اطلاق کی وضاحت کرتے ہیں۔
qPCR بڑے پیمانے پر استعمال کیا جاتا ہے، اور تجرباتی تصدیق اور نیوکلک ایسڈ کی تشخیص سب سے زیادہ استعمال شدہ منظرنامے ہیں۔
مطلق مقدار
لاگ (ابتدائی ارتکاز) کا سائیکلوں کی تعداد کے ساتھ ایک خطی تعلق ہے۔معلوم ابتدائی کاپی نمبر والے معیاری سے ایک معیاری وکر کھینچا جا سکتا ہے، یعنی ایمپلیفیکیشن ری ایکشن کا لکیری تعلق حاصل کیا جا سکتا ہے۔نمونے کی Ct قدر کے مطابق، نمونے میں ارتکاز کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔شامل کرنے کے لیے ٹیمپلیٹس کی مقدار۔

مطلق مقداری حساب کتاب کا طریقہ
مطلق مقدار کا تعین معیاری وکر پر مبنی ہونا چاہیے۔معیاری وکر بنانے کے لیے، ایک معیاری کی ضرورت ہے۔عام طور پر، معیار ایک پلازمیڈ ہے جو ہدف جین کی کلوننگ کے ذریعے حاصل کیا جاتا ہے۔یہ پلاسمڈ کیوں ہے؟کیونکہ سرکلر پلاسمڈ ڈی این اے سب سے زیادہ مستحکم ہوتا ہے۔معیاری پروڈکٹ کو 5 سے 6 گریڈینٹ میں دگنا تناسب (10 گنا کم کرنے) کے مطابق پتلا کریں، اور پتلا کرتے وقت یکسانیت پر توجہ دیں۔Ct قدر کو 15-30 کے درمیان گرنے دیں۔

معیاری تیاری
ایک ہی وقت میں، ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کو بھی اسی کے مطابق پتلا کیا جانا چاہیے (ڈائلیشن فیکٹر کو یاد رکھیں)، اور Ct ویلیو بھی 15-30 کے درمیان آنی چاہیے۔معیاری پروڈکٹ + ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کو ایک ساتھ مشین پر رکھا جاتا ہے۔دوڑ کے بعد، معیاری مادہ کے ساتھ ایک معیاری وکر بنایا گیا تھا، اور جن نمونوں کی جانچ کی جانی تھی ان کو ارتکاز کا حساب لگانے کے لیے معیاری وکر میں لایا گیا تھا۔
ہیپاٹائٹس بی وائرس ایچ بی وی کوانٹیفیکیشن ایک عام مطلق مقدار ہے، جو خون کے 1 ملی لیٹر میں وائرس کاپی نمبر کا حساب لگا سکتی ہے۔
کاپی نمبر کا حساب
نمونے کی حراستی کی جانچ کی جائے گی (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
نمونہ مالیکیولر وزن = بنیادوں کی تعداد × 324
ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کی کاپی نمبر (کاپیاں/ul) = ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کا ارتکاز / نمونے کا مالیکیولر وزن × 6 × 1014

کاپی نمبر کے حساب کا طریقہ

مقدار کا تعین کرنے کے لیے مندرجہ بالا حساب کا طریقہ ہے۔یہ ایک ریاضیاتی مسئلہ ہے جو جونیئر ہائی اسکول سے فارغ التحصیل ہونے کے بعد حل کیا جا سکتا ہے، اور ریاضی کے مسائل عام طور پر کمپیوٹر کے ذریعے حل کیے جاتے ہیں۔اگر آپ کو سمجھ نہیں آتی ہے، تو آپ بات چیت کے لیے آ سکتے ہیں۔
رشتہ دار مقدار
رشتہ دار مقدار کا تعین بنیادی طور پر سائنسی تحقیق میں استعمال ہوتا ہے۔خون کے 1 ملی لیٹر میں کتنے وائرس ہوتے ہیں، اور یہ ڈی این اے وائرس ہے، یہ نسبتاً طے شدہ واقعہ ہے: خون کی مقدار کا تعین کیا جا سکتا ہے، اور ڈی این اے وائرس نسبتاً مستحکم ہے۔تاہم، ہمارے لیے کسی پتے میں کسی مخصوص جین کی نقل نقل کی کاپیوں کی تعداد کا موازنہ کرنا مشکل ہے، کیونکہ پتی کے سائز، وزن اور نرمی کا تعین کرنا مشکل ہے، نکالے گئے RNA کی مقدار کا تعین کرنا مشکل ہے، اور ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی کا تعین کرنا بھی مشکل ہے، یعنی کسی بھی قدم سے تجرباتی ڈیٹا کو استعمال نہیں کیا جا سکتا۔
لہذا، رشتہ دار مقدار میں ایک عنصر متعارف کرانا چاہیے:اندرونی حوالہ جین
دوسرے لفظوں میں، رشتہ دار مقدار کا تعین دراصل ہدف جین اور اندرونی حوالہ جین کے درمیان موازنہ ہے۔ایک ہی ٹشو اور ایک ہی سیل کے مقابلے میں، نمونے کے سائز کا اثر، RNA نکالنے کی رقم، ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی، اور PCR کی کارکردگی نسبتاً کم ہے۔چھوٹے نمونے کے سائز کی وجہ سے، اندرونی حوالہ جات اور ہدف کے جین دونوں نسبتاً کم تھے۔یہی وجہ ہے کہ ہم پہلے بھی یکسانیت اور استحکام پر زور دیتے رہے ہیں۔
اندرونی حوالہ جین عام طور پر ہیںہاؤس کیپنگ جینز(ہاؤس کیپنگ جینز)، جو کہ جینوں کی ایک کلاس کا حوالہ دیتے ہیں جو تمام خلیات میں مستحکم طور پر ظاہر ہوتے ہیں، اور ان کی مصنوعات خلیات کی بنیادی زندگی کی سرگرمیوں کو برقرار رکھنے کے لیے ضروری ہیں۔
اس تصور کو الجھاؤ مت۔ہاؤس کیپنگ جینز حیاتیاتی فعل کی اصطلاحات ہیں، جبکہ اندرونی حوالہ جین تجرباتی تکنیکی اصطلاحات ہیں۔ہاؤس کیپنگ جینز کو توثیق پاس کرنے کی ضرورت ہوتی ہے اس سے پہلے کہ انہیں اندرونی حوالہ جین کے طور پر منتخب کیا جا سکے۔
مثال کے طور پر، ہم نے مختلف ٹشو سیلز میں ان کے اظہار کی سطح کو جانچنے کے لیے نیچے دیے گئے اعداد و شمار میں کئی ہاؤس کیپنگ جینز کا انتخاب کیا، اور پتہ چلا کہ β-2-مائکروگلوبلین کی ایکسپریشن لیول دیگر تین جینز سے بالکل مختلف ہیں، اس لیے انہیں اندرونی حوالہ جین کے طور پر استعمال نہیں کیا جا سکتا۔

اندرونی حوالہ جین کے اصلاحی فعل کو سمجھنے کے بعد، اندرونی حوالہ جین کے تعارف کی وجہ سے دو الگورتھم اخذ کیے گئے ہیں۔
· ڈبل معیاری وکر طریقہ
·2 – △△Ct طریقہ (CT قدر کے موازنہ کا طریقہ)
اگر آپ انواع اور جین کے افعال کا مطالعہ کرنے میں دلچسپی رکھتے ہیں، تو براہ کرم الگورتھم پر تحقیق ترک کر دیں اور براہ راست فارمولے استعمال کریں، یا براہ راست مشینیں استعمال کریں۔اگر آپ ریاضی اور انجینئرنگ میں سیدھے آدمی ہیں تو براہ کرم بلا جھجھک۔
ڈبل معیاری وکر طریقہ
کنٹرول سیمپل کے ٹارگٹ جین اور ہاؤس کیپنگ جین اور معیاری وکر کے ذریعے ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کی مقدار درست کریں، اور پھر حساب کے فارمولے کے مطابق رشتہ دار قدر کا حساب لگائیں، جو کہ متعلقہ اظہار کی سطح ہے۔
فوائد: سادہ تجزیہ، نسبتاً آسان تجرباتی اصلاح
نقصان: ہر جین کے لیے، تجربات کے ہر دور کو ایک معیاری وکر بنانا چاہیے۔
درخواست: جین کے اظہار کے ضابطے کے مطالعہ میں دو سب سے زیادہ استعمال شدہ اور تسلیم شدہ رشتہ دار مقداری طریقوں میں سے ایک
فارمولہ درج ذیل ہے:

مثالیں درج ذیل ہیں:

مقداری نتیجہ کی بنیاد پر متعلقہ رقم کا حساب لگائیں۔
2 – △△Ct طریقہ (CT قدر کے موازنہ کا طریقہ)

فوائد: معیاری وکر بنانے کی ضرورت نہیں ہے۔
نقصانات: یہ فرض کیا جاتا ہے کہ پرورش کی کارکردگی 100٪ کے قریب ہے۔معیاری انحراف <5% ہے، اور معیاری منحنی خطوط اور ہر امپلیفیکیشن کے درمیان کارکردگی کو ہم آہنگ سمجھا جاتا ہے۔تجرباتی حالات کی اصلاح زیادہ پیچیدہ ہے۔
درخواست: جین کے اظہار کے ضابطے کے مطالعہ میں دو سب سے زیادہ استعمال شدہ اور تسلیم شدہ رشتہ دار مقداری طریقوں میں سے ایک

بلاشبہ، ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کا مکمل طور پر ہونا ناممکن ہے 1۔ تصحیح کا طریقہ: اگر ہم جانتے ہیں کہ ٹارگٹ جین اور ریفرنس جین میں ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی ایک جیسی ہے، لیکن ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی 1 کے برابر نہیں ہے، تو 2－△△Ct کو اس طرح درست کیا جا سکتا ہے: (1+E، مثال کے طور پر اگر ایمپلیفیکیشن، 1+E) 0.95 ہے، پھر حساب کے فارمولے کو درست کر کے 1.95－△△Ct کیا جا سکتا ہے
اب تک، فلوروسینٹ مقداری پی سی آر کے بارے میں مواد ختم ہو چکا ہے۔