مسئلہ تجزیہ گائیڈ

The following is an analysis of the problems that may be encountered in the extraction of plant genomic DNA, hoping to be helpful to your experiments. In addition, for other experimental or technical problems other than operation instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us: 028-83360257 or E-mali: Tech@foregene.com.

کم پیداوار یا کوئی ڈی این اے نہیں۔

عام طور پر بہت سے عوامل ہوتے ہیں جو جینومک ڈی این اے کی پیداوار کو متاثر کرتے ہیں، بشمول نمونے کا ماخذ، نمونے کی عمر، نمونے کے ذخیرہ کرنے کے حالات، اور آپریشن۔

نکالنے کے دوران جینومک ڈی این اے حاصل نہیں کیا جا سکا

1. ٹشو کے نمونے غلط طریقے سے ذخیرہ کیے جاتے ہیں یا بہت زیادہ عرصے تک محفوظ کیے جاتے ہیں، جس کے نتیجے میں جینومک ڈی این اے کی تنزلی ہوتی ہے۔

تجویز: ٹشو کے نمونوں کو مائع نائٹروجن یا -20 میں اسٹور کریں۔°ج;جینومک ڈی این اے نکالنے کے لیے نئے جمع کیے گئے نمونے استعمال کرنے کی کوشش کریں۔

2. نمونے کی بہت کم مقدار متعلقہ جینومک ڈی این اے کو نہ نکالنے کا سبب بن سکتی ہے۔

تجویز: بافتوں کے نمونے جو طویل عرصے سے محفوظ ہیں یا جن میں جینومک ڈی این اے کی شدید کمی ہے، کافی جینومک ڈی این اے نکالنے کے لیے ٹشو کے نمونوں کی مقدار میں مناسب اضافہ کیا جا سکتا ہے۔نمونے کی مقدار کا تعین ڈی این اے کی ضروریات کے مطابق کیا جا سکتا ہے، لیکن تازہ نمونہ 100mg سے زیادہ نہیں ہونا چاہیے، اور خشک نمونہ 30mg سے زیادہ نہیں ہونا چاہیے۔

3. نمونہ مائع نائٹروجن کے ساتھ گراؤنڈ نہیں ہے یا مائع نائٹروجن کے بعد بہت دیر تک رکھا گیا ہے۔

تجویز: ڈی این اے نکالنے کے دوران، سیل کی دیوار کو توڑنے کے لیے نمونے کو مائع نائٹروجن کے ساتھ مکمل طور پر گراؤنڈ کرنے کی ضرورت ہے۔پیسنے کے بعد، براہ کرم نمونہ پاؤڈر کو 65 پر پہلے سے گرم کردہ PL1 میں منتقل کریں۔°C جتنی جلدی ممکن ہو (ایک بار زمینی پاؤڈر پگھل جائے گا، جینومک ڈی این اے تیزی سے کم ہونا شروع ہو جائے گا)۔

4. Foregene Protease کے نامناسب سٹوریج کے نتیجے میں سرگرمی کم یا غیر فعال ہو جاتی ہے۔

تجویز: فورجین پروٹیز کی سٹوریج کی شرائط کی تصدیق کریں یا انزیمیٹک ہائیڈولیسس کے لیے اسے ایک نئے فورجین پروٹیز سے بدل دیں۔

5. کٹ کو غلط طریقے سے ذخیرہ کیا جاتا ہے یا بہت لمبے عرصے تک ذخیرہ کیا جاتا ہے، جس کی وجہ سے کٹ کے کچھ اجزاء ناکام ہو جاتے ہیں۔

تجویز: متعلقہ آپریشنز کے لیے ایک نئی پلانٹ جینومک ڈی این اے ایکسٹرکشن کٹ خریدیں۔

6. کٹ کا غلط استعمال۔

تجویز: پلانٹ ڈی این اے آئسولیشن کٹ خریدیں جو پودوں کے جینومک ڈی این اے کو نکالنے اور صاف کرنے کے لیے نمونوں کے لیے وقف ہے۔

7. بفر ڈبلیو بی کو شامل کیے بغیرnhydrous ایتھنول

تجویز: بفر ڈبلیو بی میں مطلق ایتھنول کا صحیح حجم شامل کرنا یقینی بنائیں۔

8. ایلیونٹ کو سیلیکا جھلی پر صحیح طریقے سے نہیں ٹپکایا گیا تھا۔

تجویز: 65 پر پہلے سے گرم ایلیونٹ شامل کریں۔℃سیلیکا جیل کی جھلی کے وسط میں ڈراپ وائز کریں، اور اسے کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے چھوڑ دیں تاکہ اخراج کی کارکردگی میں اضافہ ہو۔

کم پیداوار والے جینومک ڈی این اے حاصل کرنے کے لیے نکالنا

1. نمونے کو غلط طریقے سے ذخیرہ کیا جاتا ہے یا زیادہ دیر تک ذخیرہ کیا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں جینومک ڈی این اے کی تنزلی ہوتی ہے۔

تجویز: ٹشو کے نمونے -20 پر اسٹور کریں۔℃;جینومک ڈی این اے نکالنے کے لیے نئے جمع کیے گئے ٹشو کے نمونے استعمال کرنے کی کوشش کریں۔

2. اگر ٹشو کے نمونوں کی مقدار بہت کم ہے، تو نکالا گیا جینومک ڈی این اے کم ہوگا۔

تجویز: کچھ پودوں کے نمونے پانی سے بھرپور ہوتے ہیں، جیسے آبی پودے جیسے کہ الجی وغیرہ، خوراک کو مناسب طریقے سے بڑھایا جا سکتا ہے یا آپریشن سے تھوڑا پہلے پانی کی کمی کی جا سکتی ہے۔

3. نمونے مائع نائٹروجن کے ساتھ اچھی طرح سے گراؤنڈ نہیں تھے یا پیسنے کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر بہت دیر تک چھوڑے گئے تھے۔

تجویز: مائع نائٹروجن پیسنے کے لئے کافی ہونا چاہئے، اور نمونہ سیل دیوار کو جتنا ممکن ہو توڑا جانا چاہئے؛پیسنے کے فوراً بعد، نمونہ پاؤڈر کو 65 پر منتقل کیا جانا چاہیے۔℃اگلے مرحلے کے لیے پہلے سے گرم بفر PL1۔

4. صحیح کٹ استعمال نہ کرنا۔

تجویز: پودوں کے جینومک ڈی این اے کو نکالنے اور صاف کرنے کے لیے ایک مخصوص پلانٹ ڈی این اے آئسولیشن کٹ استعمال کریں۔

5. فارجین پروٹیز کا غلط ذخیرہ کرنے کے نتیجے میں سرگرمی کم یا غیر فعال ہوجاتی ہے۔

تجویز: فورجین پروٹیز کی سٹوریج کی شرائط کی تصدیق کریں یا انزیمیٹک ہائیڈولیسس کے لیے اسے ایک نئے فورجین پروٹیز سے بدل دیں۔

6. Eluent مسئلہ

تجویز: برائے مہربانی elution کے لیے بفر EB استعمال کریں۔اگر ddH استعمال کر رہے ہیں۔₂O یا دیگر ایلیونٹ، یقینی بنائیں کہ ایلیونٹ کا پی ایچ 7.0-8.5 کے درمیان ہے۔

7. ایلیونٹ صحیح طریقے سے نہیں ٹپکتا ہے۔

تجویز: براہ کرم ایلیوشن ڈراپ کو سلیکا جھلی کے وسط میں شامل کریں اور اسے کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ تک چھوڑ دیں تاکہ اخراج کی کارکردگی میں اضافہ ہو۔

8. ایلیونٹ والیوم بہت چھوٹا ہے۔

تجویز: براہ کرم ہدایات کے مطابق جینومک ڈی این اے کے اخراج کے لیے ایلیونٹ استعمال کریں، کم از کم 100 سے کم نہ ہوں۔μl.

کم طہارت کے ساتھ جینومک ڈی این اے نکالا گیا۔

جینومک ڈی این اے کی کم پاکیزگی بہاؤ کے تجربات کی ناکامی یا خراب اثر کا باعث بنے گی، جیسے: انزائم کو کاٹا نہیں جا سکتا، اور ہدف جین کا ٹکڑا PCR کے ذریعے حاصل نہیں کیا جا سکتا۔

1. متفرق پروٹین کی آلودگی، RNA آلودگی۔

تجزیہ: کالم کو دھونے کے لیے بفر پی ڈبلیو کا استعمال نہیں کیا گیا تھا۔بفر پی ڈبلیو درست سینٹرفیوگریشن رفتار سے کالم کو دھونے کے لیے استعمال نہیں کیا گیا تھا۔

تجویز: اس بات کو یقینی بنانے کی کوشش کریں کہ جب سپرنیٹنٹ کالم سے گزرے تو اس میں کوئی بارش نہ ہو۔ہدایات کے مطابق پیوریفیکیشن کالم کو بفر پی ڈبلیو سے دھونا یقینی بنائیں، اور اس قدم کو چھوڑا نہیں جا سکتا۔

2. نجاست آئن آلودگی۔

تجزیہ: بفر ڈبلیو بی واش کالم کو چھوڑ دیا گیا تھا یا صرف ایک بار دھویا گیا تھا، جس کے نتیجے میں بقایا آئنک آلودگی ہوتی ہے۔

سفارش: بفر ڈبلیو بی کے ساتھ دو بار دھونا یقینی بنائیں تاکہ زیادہ سے زیادہ بقایا آئنوں کو ہٹایا جاسکے۔

3. RNase آلودگی۔

تجزیہ: Exogenous RNase بفر میں شامل کیا جاتا ہے۔Buffer PW میں دھونے کے غلط آپریشن کے نتیجے میں بقایا RNase نکلے گا اور نیچے دھارے والے RNA تجرباتی آپریشنز کو متاثر کرے گا، جیسے وٹرو ٹرانسکرپشن میں۔

تجویز: فارجین سیریز نیوکلک ایسڈ نکالنے والی کٹس اضافی RNase کے بغیر RNA کو ہٹا سکتی ہیں، اور پلانٹ DNA Isolation Kit میں موجود تمام ریجنٹس کو RNase کی ضرورت نہیں ہے۔ہدایات کے مطابق پیوریفیکیشن کالم کو بفر پی ڈبلیو سے دھونا یقینی بنائیں، اور اس قدم کو چھوڑا نہیں جا سکتا۔

4. ایتھنول کی باقیات۔

تجزیہ: بفر ڈبلیو بی کے ساتھ پیوریفیکیشن کالم کو دھونے کے بعد، کوئی خالی ٹیوب سینٹرفیوگریشن نہیں کی گئی۔

تجویز: مناسب خالی ٹیوب سینٹرفیوگریشن کے لیے ہدایات پر عمل کریں۔

ہدایت نامہ:

پلانٹ ڈی این اے آئسولیشن کٹ انسٹرکشن مینول