یہ بات مشہور ہے کہ مرکزی عقیدہ میں، آر این اے ڈی این اے اور پروٹین کے اظہار کے درمیان ٹرانسکرپشن ثالث ہے۔ڈی این اے کی کھوج کے مقابلے میں، آر این اے کا پتہ لگانے سے جانداروں میں جین کے اظہار کو زیادہ معروضی طور پر ظاہر کیا جا سکتا ہے۔RNA کے تجربات میں شامل ہیں: qRT-PCR، RNA-Seq، اور فیوژن جین کا پتہ لگانا، وغیرہ خود RNA کی خصوصیات کی بنیاد پر (RNA کے شوگر کی انگوٹھی میں DNA کی شوگر رِنگ سے ایک زیادہ فری ہائیڈروکسیل گروپ ہوتا ہے)، ماحول میں RNases کی ایک بڑی تعداد کے ساتھ مل کر، RNA زیادہ غیر مستحکم ہوتا ہے اور DNA کو کم کرنا آسان ہے۔کچرا اندر، کچرا باہر، اگر آر این اے کا معیار اچھا نہیں ہے، تو تجرباتی نتائج غیر تسلی بخش ہونے چاہئیں، خاص طور پر غلط اعداد و شمار یا ناقص تکرار کے طور پر ظاہر ہوتے ہیں۔لہذا، RNA کی پروسیسنگ پر زیادہ توجہ دی جانی چاہیے، اور بعد میں آنے والے تجرباتی ڈیٹا کی درستگی اور درستگی کو یقینی بنانے کے لیے کوالٹی کنٹرول کا لنک بھی زیادہ اہم ہے۔

آر این اے کے کوالٹی کنٹرول کے لیے، عام طور پر درج ذیل عام طور پر استعمال شدہ طریقے ہیں:

• سپیکٹرو فوٹومیٹری
• ایگروز جیل الیکٹروفورسس
• Agilent Bioanalyzer
• ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری پی سی آر
• کیوبٹ فلوروسینٹ رنگنے کا طریقہ

01 سپیکٹرو فوٹومیٹری

آر این اے کے کنجوجیٹڈ ڈبل بانڈ ہیں اور اس کی جذب کی چوٹی 260nm کی طول موج پر ہے۔لیمبرٹ بیئر کے قانون کے مطابق، ہم 260nm پر جذب کی چوٹی سے RNA کی حراستی کا حساب لگا سکتے ہیں۔اس کے علاوہ، ہم 260nm، 280nm اور 230nm جذب چوٹیوں کے تناسب کے مطابق RNA کی پاکیزگی کا حساب بھی لگا سکتے ہیں۔280nm اور 230nm بالترتیب پروٹین اور چھوٹے مالیکیولز کے جذب کی چوٹی ہیں۔A260/A280 اور A260/A230 کا کوالیفائیڈ RNA پیوریٹی کا تناسب 2 سے زیادہ ہونا چاہیے۔ اگر یہ 2 سے کم ہے تو اس کا مطلب ہے کہ RNA نمونے میں پروٹین یا چھوٹے مالیکیول کی آلودگی ہے اور اسے دوبارہ صاف کرنے کی ضرورت ہے۔آلودگی کے ذرائع بہاؤ کے تجربات کو متاثر کریں گے، جیسے کہ PCR کے رد عمل کی افادیت کی کارکردگی کو روکنا، جس کے نتیجے میں غلط مقداری نتائج برآمد ہوتے ہیں۔آر این اے کی پاکیزگی کا بعد کے نتائج پر بہت زیادہ اثر ہوتا ہے، لہذا سپیکٹرو فوٹومیٹری عام طور پر نیوکلک ایسڈ کے تجربات کے پہلے مرحلے میں ایک ناگزیر کوالٹی کنٹرول لنک ہے۔

شکل 1. عام RNA/DNA جذب سپیکٹرم

02 ایگاروز جیل الیکٹروفورسس

پاکیزگی کے علاوہ، RNA کی سالمیت بھی RNA کے معیار کو جانچنے کے لیے اہم اشارے میں سے ایک ہے۔آر این اے کا انحطاط نمونے میں بڑی تعداد میں چھوٹے ٹکڑوں کا باعث بنے گا، اس لیے آر این اے کے ٹکڑوں کی تعداد کم ہو جائے گی جن کا مؤثر طریقے سے پتہ لگایا جا سکتا ہے اور حوالہ کی ترتیب سے احاطہ کیا جا سکتا ہے۔آر این اے کی سالمیت کو 1٪ ایگروز جیل پر کل آر این اے کے الیکٹروفورسس کے ذریعہ چیک کیا جاسکتا ہے۔یہ طریقہ جیل کو خود ترتیب دے سکتا ہے، یا سالمیت کی جانچ کے لیے پہلے سے تیار کردہ E-Gel™ سسٹم کا استعمال کر سکتا ہے۔کل RNA کا 80% سے زیادہ رائبوسومل RNA ہے، جس کی اکثریت 28S اور 18S rRNA (ممالیہ کے نظاموں میں) پر مشتمل ہے۔اچھے معیار کا RNA دو واضح روشن بارز دکھائے گا، جو بالترتیب 28S اور 18S روشن بار ہیں، 5 Kb اور 2 Kb پر، اور تناسب 2:1 کے قریب ہوگا۔اگر یہ پھیلی ہوئی حالت میں ہے، تو اس کا مطلب ہے کہ RNA کا نمونہ کم ہو سکتا ہے، اور RNA کے معیار کو مزید جانچنے کے لیے بعد میں بیان کردہ طریقہ استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

تصویر 2. ایگروز جیل الیکٹروفورسس پر انحطاط شدہ (لین 2) اور برقرار آر این اے (لین 3) کا موازنہ

03 Agilent Bioanalyzer

اوپر بیان کردہ ایگرز جیل الیکٹروفورسس طریقہ کے علاوہ، جو ہمیں آسانی سے اور جلدی سے RNA کی سالمیت کی شناخت کرنے میں مدد کر سکتا ہے، ہم RNA کی سالمیت کا تعین کرنے کے لیے Agilent bioanalyzer کا بھی استعمال کر سکتے ہیں۔یہ RNA کی ارتکاز اور سالمیت کا اندازہ لگانے کے لیے مائکرو فلائیڈکس، کیپلیری الیکٹروفورسس، اور فلوروسینس کا مجموعہ استعمال کرتا ہے۔RNA نمونے کے پروفائل کا تجزیہ کرنے کے لیے بلٹ ان الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے، Agilent bioanalyzer ایک حوالہ RNA سالمیت کی قدر، RNA Integrity Number (جس کے بعد RIN کہا جاتا ہے) کا حساب لگا سکتا ہے [1]۔RIN کی قدر جتنی زیادہ ہوگی، RNA کی سالمیت اتنی ہی زیادہ ہوگی (1 انتہائی تنزلی کا شکار ہے، 10 سب سے مکمل ہے)۔کچھ تجربات جن میں RNA شامل ہے معیار کی تشخیص کے لیے RIN کو بطور پیرامیٹر استعمال کرنے کا مشورہ دیتے ہیں۔مثال کے طور پر ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ تجربات (جس کے بعد NGS کہا جاتا ہے) کو لے کر، Oncomine™ Human Immune Repertoire کے رہنما خطوط، جو تھرمو فشر کی آنکومین پینل سیریز میں B سیل اور T سیل اینٹیجن ریسیپٹرز کا پتہ لگانے کے لیے استعمال ہوتے ہیں، تجویز کرتے ہیں کہ RIN اقدار والے نمونے 4، 3 سے زیادہ پڑھے جا سکتے ہیںمختلف پینلز کے لیے مختلف تجویز کردہ رینجز ہیں، اور اکثر زیادہ RIN زیادہ موثر ڈیٹا لا سکتا ہے۔

شکل 3، Oncomine™ ہیومن امیون ریپرٹوائر تجربات میں، 4 سے زیادہ RIN والے نمونے زیادہ موثر ریڈز اور T سیل کلون کا پتہ لگا سکتے ہیں۔【2】

تاہم، RIN قدر کی بھی کچھ حدود ہیں۔اگرچہ RIN کا NGS تجرباتی ڈیٹا کے معیار کے ساتھ اعلی تعلق ہے، لیکن یہ FFPE نمونوں کے لیے موزوں نہیں ہے۔ایف ایف پی ای کے نمونوں کا طویل عرصے سے کیمیائی علاج کیا گیا ہے، اور نکالے گئے آر این اے کی عام طور پر نسبتاً کم RIN قدر ہوتی ہے۔تاہم، اس کا مطلب یہ نہیں ہے کہ تجربے کا موثر ڈیٹا غیر اطمینان بخش ہونا چاہیے۔FFPE نمونوں کے معیار کا درست اندازہ لگانے کے لیے، ہمیں RIN کے علاوہ دیگر پیمائشیں استعمال کرنے کی ضرورت ہے۔RIN کے علاوہ، Agilent bioanalyzer DV200 قدر کو RNA معیار کے تشخیصی پیرامیٹر کے طور پر بھی شمار کر سکتا ہے۔DV200 ایک پیرامیٹر ہے جو RNA نمونے میں 200 bp سے بڑے ٹکڑوں کے تناسب کا حساب لگاتا ہے۔DV200 RIN کے مقابلے FFPE نمونے کے معیار کا بہتر اشارہ ہے۔ایف ایف پی ای کے ذریعے نکالے گئے آر این اے کے لیے، اس کا جینوں کی تعداد کے ساتھ بہت زیادہ تعلق ہے جن کا مؤثر طریقے سے پتہ لگایا جا سکتا ہے اور جین کے تنوع [3]۔اگرچہ DV200 FFPE کے معیار کا پتہ لگانے میں خامیوں کو پورا کر سکتا ہے، لیکن Agilent bioanalyzer پھر بھی RNA نمونوں میں معیار کے مسائل کا جامع تجزیہ نہیں کر سکتا، بشمول نمونوں میں روکنے والے بھی۔روکنے والے خود بہاوی تجربات کی افادیت کی کارکردگی کو متاثر کر سکتے ہیں اور مفید ڈیٹا کی مقدار کو کم کر سکتے ہیں۔یہ جاننے کے لیے کہ آیا نمونے میں کوئی روک تھام کرنے والا ہے، ہم ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری PCR طریقہ اپنا سکتے ہیں جو آگے بیان کیا گیا ہے۔

04 ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری پی سی آر

ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری PCR طریقہ نہ صرف نمونے میں روکنے والوں کا پتہ لگا سکتا ہے بلکہ FFPE نمونے میں RNA کے معیار کو بھی درست طریقے سے ظاہر کرتا ہے۔Agilent حیاتیاتی تجزیہ کاروں کے مقابلے میں، ریئل ٹائم فلوروسینس مقداری آلات اپنے وسیع تر استعمال کی وجہ سے بڑی حیاتیاتی تجربہ گاہوں میں زیادہ مقبول ہیں۔آر این اے کے نمونوں کے معیار کو جانچنے کے لیے، ہمیں صرف اندرونی حوالہ جات کے لیے پرائمر پروبس خریدنے یا تیار کرنے کی ضرورت ہے، جیسے GUSB (Cat no. Hs00939627)۔مطلق مقداری تجربات کرنے کے لیے پرائمر، تحقیقات اور معیارات (معلوم ارتکاز کا کل RNA) کے اس مجموعے کا استعمال کرتے ہوئے، مؤثر RNA ٹکڑے کی ارتکاز کو RNA معیار (فنکشنل RNA کوانٹیٹیشن (FRQ) مختصر کے لیے) کے تشخیصی معیار کے طور پر شمار کیا جا سکتا ہے۔ایک NGS ٹیسٹ میں، ہم نے پایا کہ RNA نمونوں کے FRQ کا ڈیٹا کے موثر حجم کے ساتھ بہت زیادہ تعلق ہے۔0.2ng/uL FRQ سے زیادہ تمام نمونوں کے لیے، کم از کم 70% ریڈز مؤثر طریقے سے حوالہ کی ترتیب کا احاطہ کر سکتے ہیں (شکل 4)۔

شکل 4، فلوروسینس مقداری طریقہ کے ذریعے دریافت کی گئی FRQ قدر کا NGS تجربے میں حاصل کیے گئے موثر ڈیٹا کے ساتھ بہت زیادہ ارتباط (R2>0.9) ہے۔سرخ لکیر 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) کے برابر FRQ قدر ہے۔【4】

ایف ایف پی ای کے نمونوں پر لاگو ہونے کے علاوہ، ریئل ٹائم مقداری پی سی آر طریقہ نمونوں میں روکنے والوں کی مؤثر طریقے سے نگرانی بھی کر سکتا ہے۔ہم داخلی مثبت کنٹرول (IPC) اور اس کے پرکھ کے ساتھ رد عمل کے نظام میں پتہ لگانے کے لیے نمونہ شامل کر سکتے ہیں، اور پھر Ct قدر حاصل کرنے کے لیے فلوروسینس کوانٹیفیکیشن انجام دے سکتے ہیں۔اگر سی ٹی ویلیو غیر نمونہ کے رد عمل میں Ct قدر سے پیچھے رہ جاتی ہے، تو یہ اشارہ کرتا ہے کہ روکنے والا نمونے میں موجود ہے اور رد عمل میں امپلیفیکیشن کی کارکردگی کو روکتا ہے۔

05 کیوبٹ فلوروسینٹ ڈائی کا طریقہ

کیوبٹ فلورومیٹر نیوکلک ایسڈ کے ارتکاز اور پاکیزگی کا پتہ لگانے کے لیے سب سے زیادہ استعمال ہونے والا چھوٹا آلہ ہے، جو چلانے میں آسان ہے اور تقریباً ہر سالماتی حیاتیات لیبارٹری میں موجود ہے۔یہ نیوکلک ایسڈ کے ارتکاز کا پتہ لگانے اور نیوکلیک ایسڈ بائنڈنگ فلوروسینٹ ڈائی (کیوبٹ ڈیٹیکشن ری ایجنٹ) کے ذریعے درست طریقے سے حساب لگاتا ہے۔کیوبٹ میں اعلیٰ حساسیت اور خاصیت ہے، اور RNA کو pg/µL ارتکاز تک درست طریقے سے کم کر سکتا ہے۔نیوکلک ایسڈ کے ارتکاز کو درست طریقے سے درست کرنے کی معروف صلاحیت کے علاوہ، تھرمو فشر کا تازہ ترین نیا ماڈل، کیوبٹ 4.0، RNA کی سالمیت کا بھی پتہ لگا سکتا ہے۔Qubit 4.0′s RNA ڈیٹیکشن سسٹم (RNA IQ Assay) بیک وقت دو مخصوص فلوروسینٹ رنگوں کا پتہ لگا کر RNA کی سالمیت کا پتہ لگاتا ہے۔یہ دو فلوروسینٹ رنگ بالترتیب RNA کے بڑے ٹکڑوں اور چھوٹے ٹکڑوں سے منسلک ہو سکتے ہیں۔یہ دو فلوروسینٹ رنگ نمونے میں آر این اے کے بڑے ٹکڑوں کے تناسب کی نشاندہی کرتے ہیں، اور اس سے آر این اے کے معیار کی نمائندگی کرنے والی آئی کیو (انٹیگریٹی اور کوالٹی) کی قدر کا اندازہ لگایا جا سکتا ہے۔آئی کیو ویلیو FFPE اور غیر FFPE دونوں نمونوں پر لاگو ہوتی ہے، اور اس کے بعد کی ترتیب کے معیار پر بہت زیادہ اثر ہوتا ہے۔NGS کے تجربات کو مثال کے طور پر لیتے ہوئے، Ion torrent™ پلیٹ فارم پر کیے گئے RNA-Seq ٹیسٹ کے تجربات میں، 4 سے زیادہ آئی کیو ویلیوز والے زیادہ تر نمونوں میں کم از کم 50% مؤثر پڑھے گئے تھے (شکل 5)۔اوپر بیان کیے گئے پتہ لگانے کے طریقوں کے مقابلے میں، Qubit IQ Assay نہ صرف کام کرنے میں زیادہ آسان ہے اور اس میں کم وقت لگتا ہے (پانچ منٹ کے اندر)، بلکہ اس کا پیرامیٹر IQ ویلیو اور بہاو تجربات کے ڈیٹا کے معیار کے درمیان بہت اچھا تعلق ہے۔

شکل 5، Qubit RNA IQ ویلیو اور RNA-Seq کے میپ شدہ ریڈز کے درمیان بہت اچھا تعلق ہے۔【5】

مندرجہ بالا تعارف کے ذریعے، مجھے یقین ہے کہ ہر ایک کو RNA کوالٹی کنٹرول کے مختلف طریقوں کی کافی سمجھ ہے۔عملی طور پر، آپ کو منتخب کر سکتے ہیںنمونے کی قسم اور موجودہ آلات کے مطابق متعلقہ طریقہ۔صرف آر این اے کے معیار کو اچھی طرح سے کنٹرول کرکے ہی ہم نمونے کے خراب معیار کی وجہ سے آنے والے تجربات کی ناکامی سے بچ سکتے ہیں، اس طرح قیمتی وقت، توانائی اور لاگت کی بچت ہوتی ہے۔

حوالہ مصنوعات:

جانوروں کی ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ

سیل ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ

حوالہ جات

【1】شروڈر، A.، Mueller، O.، Stocker، S. et al.RIN: RNA پیمائش کو سالمیت کی قدریں تفویض کرنے کے لیے ایک RNA سالمیت نمبر۔بی ایم سی مالیکیولر بائیول 7، 3 (2006)۔https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

2

3 357-373،https://doi.org/10.1093/toxsci/