ہم تجربہ کار صنعت کار رہے ہیں۔بڑی رعایتی چائنا ہائی سنسیٹیویٹی ون سٹیپ پروب Rt- کے لیے اپنی مارکیٹ کے اہم سرٹیفیکیشنز میں اکثریت حاصل کرنا۔کیو پی سی آرکٹ V2، معیار فیکٹری کی زندگی ہے، گاہک کی مانگ پر توجہ کمپنی کی بقا اور ترقی کا ذریعہ ہے، ہم ایمانداری اور نیک نیتی سے کام کرنے والے رویے پر قائم ہیں، آپ کے آنے کے منتظر ہیں!
ہم تجربہ کار صنعت کار رہے ہیں۔کے لیے اس کی مارکیٹ کے اہم سرٹیفیکیشنز میں اکثریت حاصل کرناچائنا ٹاک ڈی این اے پولیمریز, کیو پی سی آر، ہماری کمپنی کا وعدہ ہے: مناسب قیمتیں، مختصر پیداواری وقت اور تسلی بخش بعد از فروخت سروس، ہم آپ کو کسی بھی وقت ہماری فیکٹری کا دورہ کرنے کے لیے خوش آمدید کہتے ہیں۔کاش اب ہم ایک ساتھ ایک خوشگوار اور طویل مدتی کاروبار کریں!!!

تفصیل

یہ کٹ ایک منفرد lysis بفر سسٹم کا استعمال کرتی ہے جو RT-qPCR کے رد عمل کے لیے کلچرڈ سیل کے نمونوں سے RNA کو تیزی سے جاری کر سکتا ہے، اس طرح RNA صاف کرنے کے وقت طلب اور محنتی عمل کو ختم کر دیتا ہے۔آر این اے ٹیمپلیٹ صرف 7 منٹ میں حاصل کیا جا سکتا ہے۔کٹ کے ذریعہ فراہم کردہ 5×Direct RT مکس اور 2×Direct qPCR مکس-SYBR ری ایجنٹس تیزی سے اور مؤثر طریقے سے حقیقی وقت کے مقداری PCR نتائج حاصل کر سکتے ہیں۔

5×Direct RT مکس اور 2×Direct qPCR Mix-SYBR میں مضبوط روک تھام کرنے والی رواداری ہے، اور نمونوں کی lysate کو براہ راست RT-qPCR کے سانچے کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔اس کٹ میں منفرد آر این اے ہائی فینیٹی فارجین ریورس ٹرانسکرپٹیز، اور ہاٹ ڈی ٹاک ڈی این اے پولیمریز، ڈی این ٹی پیز، ایم جی سی ایل شامل ہیں۔₂، ردعمل بفر، پی سی آر آپٹیمائزر اور سٹیبلائزر۔

وضاحتیں

200×20μl Rxns، 1000×20μl Rxns

کٹ کے اجزاء

خصوصیات اور فوائد

■ سادہ اور موثر : سیل ڈائریکٹ RT ٹیکنالوجی کے ساتھ، RNA نمونے صرف 7 منٹ میں حاصل کیے جا سکتے ہیں۔

■ نمونے کی مانگ کم ہے، کم از کم 10 سیلز کی جانچ کی جا سکتی ہے۔

■ ہائی تھرو پٹ: یہ 384، 96، 24، 12، 6 کنویں پلیٹوں میں مہذب خلیوں میں RNA کا تیزی سے پتہ لگا سکتا ہے۔

■ ڈی این اے صاف کرنے والا جاری ہونے والے جینوم کو تیزی سے ہٹا سکتا ہے، بعد میں آنے والے تجرباتی نتائج پر اثرات کو بہت کم کر سکتا ہے۔

■ آپٹمائزڈ RT اور qPCR سسٹم دو قدمی RT-PCR ریورس ٹرانسکرپشن کو زیادہ موثر اور PCR کو زیادہ مخصوص، اور RT-qPCR ردعمل روکنے والوں کے خلاف زیادہ مزاحم بناتا ہے۔

کٹ کی درخواست

درخواست کا دائرہ: مہذب خلیات۔

- نمونہ لیسس کے ذریعہ جاری کردہ RNA: صرف اس کٹ کے RT-qPCR ٹیمپلیٹ پر لاگو ہوتا ہے۔

- کٹ کو درج ذیل مقاصد کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے: جین کے اظہار کا تجزیہ، siRNA-ثالثی جین کے خاموشی کے اثر کی تصدیق، منشیات کی اسکریننگ وغیرہ۔

خاکہ

اسٹوریج اور شیلف زندگی

اس کٹ کے حصہ I کو 4℃ پر ذخیرہ کیا جانا چاہیے۔حصہ II کو -20℃ پر ذخیرہ کیا جانا چاہیے۔

فارجین پروٹیز پلس II کو 4℃ پر ذخیرہ کیا جانا چاہیے، -20℃ پر منجمد نہ کریں۔

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR کو اندھیرے میں -20℃ پر ذخیرہ کیا جانا چاہیے۔اگر کثرت سے استعمال کیا جائے تو اسے قلیل مدتی سٹوریج کے لیے 4℃ پر بھی ذخیرہ کیا جا سکتا ہے (10 دن کے اندر استعمال کریں)۔ہم تجربہ کار صنعت کار ہیں۔بڑی رعایتی چائنا ہائی سنسیٹیویٹی ون سٹیپ پروب Rt-Qpcr Kit V2 کے لیے اپنی مارکیٹ کے اہم سرٹیفیکیشن میں اکثریت حاصل کرنا، معیار فیکٹری کی زندگی ہے، گاہک کی مانگ پر توجہ کمپنی کی بقا اور ترقی کا ذریعہ ہے، ہم ایمانداری اور نیک نیتی سے کام کرنے والے رویے کی پاسداری کرتے ہیں، آپ کے آنے کے منتظر ہیں!
بڑی چھوٹچائنا ٹاک ڈی این اے پولیمریز, Qpcr، ہماری کمپنی وعدہ کرتی ہے: مناسب قیمتیں، مختصر پیداواری وقت اور تسلی بخش بعد از فروخت سروس، ہم آپ کو کسی بھی وقت ہماری فیکٹری کا دورہ کرنے کا خیرمقدم کرتے ہیں۔کاش اب ہم ایک ساتھ ایک خوشگوار اور طویل مدتی کاروبار کریں!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qپی سی آر Kit -تقمan

Cat.No.DRT-01021/01022

≤ 1000,000 سیلز کا استعمال کرتے ہوئے سیل ڈائریکٹ RT-qPCR کے لیے

مصنوعات کا تعارف

یہ پراڈکٹ RT-qPCR کے رد عمل کے لیے کلچرڈ سیل کے نمونوں سے RNA کو فوری طور پر جاری کرنے کے لیے ایک منفرد lysis بفر سسٹم کا استعمال کرتی ہے، جس سے وقت طلب اور محنت طلب RNA صاف کرنے کے عمل کو ختم کیا جاتا ہے، اور مطلوبہ RNA ٹیمپلیٹ حاصل کرنے کے لیے صرف 7 منٹ، 5× Direct RT مکس، 2× Direct qPCR Mix-Taciant کے ذریعے فوری طور پر فراہم کیا جاتا ہے۔ نتائج

5× ڈائریکٹ RT مکس اور 2 × ڈائریکٹ qPCR مکس-تقمان میں مضبوط روک تھام کرنے والی رواداری ہے اور یہ نمونے کے لائسیٹ کا استعمال کرتے ہوئے ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر پیمائش کرنے کے لیے موثر الٹ اور مخصوص ایمپلیفیکیشن انجام دے سکتے ہیں۔ریجنٹ میں Foregene Reverse Transscriptase، Hot D-Taq DNA Polymerase، dNTPs، MgCl ہوتا ہے۔₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer اور Stabilizer، جو lysis buffer کے ساتھ نمونوں کا جلدی اور آسانی سے پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، اور اس میں اعلیٰ حساسیت، مخصوصیت اور استحکام کی خصوصیات ہیں۔

مصنوعات کی خصوصیات

سادہ، موثر سیل ڈائریکٹ RT ٹیکنالوجی جو RNA نمونے حاصل کرنے میں 7 منٹ سے بھی کم وقت لیتی ہے۔

نمونے کی ضروریات چھوٹی ہیں، اور تجربے کے لیے کم از کم 10 مہذب خلیات استعمال کیے جا سکتے ہیں۔

مہذب خلیوں جیسے 384، 96، 24، 12، اور 6 کنویں پلیٹوں کے تیزی سے آر این اے کے حصول کے لیے ہائی تھرو پٹ۔

ڈی این اے ایریزر جاری ہونے والے جینوم کو تیزی سے ہٹانے کے قابل ہے، جس سے بعد میں آنے والے تجرباتی نتائج پر اثر بہت کم ہو جاتا ہے۔

آپٹمائزڈ RT اور qPCR نظام دو قدمی RT-PCR کو زیادہ موثر ریورس ٹرانسکرپشن، مخصوصیت، اور مضبوط RT-qPCR رد عمل روکنے والے رواداری کے ساتھ قابل بناتے ہیں۔

کٹ کی درخواست

درخواست کا دائرہ: مہذب خلیات۔

نمونہ لیسس کی تشریح شدہ RNA: صرف دو قدمی RT-qPCR ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔

کٹس کو درج ذیل مقاصد کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے: جین ریگولیٹری ایکسپریشن کا تجزیہ، ایلیل ٹیسٹنگ، ڈرگ اسکریننگ وغیرہ۔

کٹ کی حدود

بڑھے ہوئے ٹکڑے ≤ 300 bp۔

کٹس کا استعمال سیلز کو تازہ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔

پروڈکٹ کوالٹی کنٹرول

FOREGENE کے ٹوٹل کوالٹی مینجمنٹ سسٹم کے مطابق، Cell Direct RT-qPCR سیریز کی کٹس کے ہر بیچ کا کڑی جانچ کی جاتی ہے تاکہ کٹس کے ہر بیچ کے معیار کی وشوسنییتا اور استحکام کو یقینی بنایا جا سکے۔

کٹ کا مواد

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman کو الگ سے خریدا جا سکتا ہے، تفصیلات ضمیمہ 1 (صفحہ 13) میں فراہم کی گئی ہیں۔

ذخیرہ کرنے کے حالات

1. شپنگ کی شرائط

کم درجہ حرارت کے آئس پیک باکس کی نقل و حمل کا پورا عمل، اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ کٹ <4 °C حالت میں ہے۔

2. ذخیرہ کرنے کے حالات

حصہ I کو 4°C پر اور حصہ II -20°C پر اسٹور کریں۔

Foregene Protease Plus II کو 4°C پر ذخیرہ کیا جانا چاہئے، -20°C پر منجمد نہیں ہونا چاہئے۔

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman کو -20°C، یا قلیل مدتی استعمال کے لیے 4°C پر ذخیرہ کیا جاتا ہے اگر اسے کثرت سے استعمال کیا جائے (10 دنوں کے اندر)۔

کٹ کے اجزاء کی معلومات

Buffer CL: سیل lysis کے رد عمل کے لیے درکار ماحول فراہم کرتا ہے۔

Buffer ST: بعد میں RT پر اثرات سے بچنے کے لیے lysate میں موجود فعال مادہ کو ختم کرتا ہے۔

ڈی این اے صاف کرنے والا: ڈی این اے ہٹانے والا، بعد کے تجربات پر جینوم کو ہٹانے کا اثر۔

5× ڈائریکٹ RT مکس: زیادہ سے زیادہ سیدھ میں لانے کے لیے اعلیٰ RNA وابستگی Foregene Reverse Transscriptase، RNase Inhibitor، dNTPs، اسٹیبلائزرز، اینہانسرز، آپٹیمائزرز، اور ریورس ٹرانسکرپشن پرائمر پر مشتمل ہے (رینڈم پرائمر، اولیگو(dT)₁₈پرائمر)۔

Foregene Protease Plus II: lysis buffer کے تناظر میں، خلیات کو نیوکلک ایسڈ جاری کرنے کے لیے لیس کیا جاتا ہے۔

2× ڈائریکٹ qPCR مکس-تقمان: اس ریجنٹ میں گرم D-Taq DNA پولیمریز، dNTPs، MgCl ہوتا ہے₂، ردعمل بفر، پی سی آر آپٹیمائزر، اور سٹیبلائزر۔

20× ROX حوالہ رنگ: عام طور پر ABI، Stratagene اور دیگر کمپنیوں کے ریئل ٹائم پی سی آر ایمپلیفیکیشن آلات پر استعمال کیا جاتا ہے، یہ پی سی آر ٹیوبوں اور پی سی آر ڈوزنگ کی غلطیوں کی وجہ سے ہونے والی ٹیوبوں کے درمیان فرق کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔مختلف آلات کے لیے درکار 20× ROX ریفرنس ڈائی کا ارتکاز مختلف ہے، اور صارف اسے آلے کی تجویز کردہ حراستی کے مطابق شامل کر سکتا ہے۔

RNase فری ddH₂O: دو قدمی RT-qPCR رد عمل کے لیے RNase فری جراثیم سے پاک الٹرا خالص پانی۔

احتیاطی تدابیر:(کِٹ استعمال کرنے سے پہلے احتیاطی تدابیر کو ضرور پڑھیں)

نمونوں کے درمیان کراس آلودگی سے بچنے کے لیے تجربے کے آپریشن کے طریقہ کار پر توجہ دیں۔

RNase آلودگی اور RNA کے انحطاط سے بچنے کے لیے تجرباتی ماحول اور برتنوں کی صفائی پر توجہ دیں۔

تازہ یا اچھی طرح سے محفوظ شدہ سیل کے نمونے لیں اور کبھی بھی بار بار منجمد پگھلے ہوئے سیل کے نمونے استعمال نہ کریں۔

5× ڈائریکٹ کیو پی سی آر مکس، 2× ڈائریکٹ کیو پی سی آر مکس-تقمان کو بار بار جمنے سے گریز کرنا چاہیے، ورنہ یہ ریورس ٹرانسکرپشن اور پی سی آر کی کارکردگی کو متاثر کرے گا۔

پریپاراشنپہلےآپریشن

اس کٹ کو استعمال کرنے سے پہلے ہدایات کو احتیاط سے پڑھیں۔Cell Direct RT-qPCR کٹ آسان، آسان اور کام کرنے میں تیز ہے، اور ہدایات پوری کٹ کے بارے میں مکمل معلومات فراہم کرتی ہیں اور اسے صحیح طریقے سے استعمال کرنے کے طریقے فراہم کرتی ہیں۔براہ کرم استعمال سے پہلے ضروری تجرباتی مواد اور سامان تیار کریں۔

تجرباتی مواد اور سامان

◆ کلچر سیل۔

◆ 1.5 ملی لیٹر یا 2 ملی لیٹر، RNase-/DNase-Free centrifuge tube، RNase-/DNase-Free tip، 0.2 ml sterile qPCR ٹیوب۔

◆ کیو پی سی آر مشین، پائپیٹ، ٹیبل ٹاپ سینٹری فیوج (≥13,400×g) (تجرباتی ضروریات پر منحصر ہے) وغیرہ۔

حفاظت

◆ یہ پروڈکٹ صرف سائنسی تحقیق کے مقاصد کے لیے ہے، براہ کرم اسے دواسازی، طبی، خوراک اور کاسمیٹک مقاصد کے لیے استعمال نہ کریں۔

◆ کیمیکل استعمال کرتے وقت، مناسب لیب کے کپڑے، دستانے، حفاظتی شیشے وغیرہ پہنیں۔

آپریشنرہنما

سیل لائسس سسٹمز، آر ٹی سسٹمز، اور کیو پی سی آر ری ایکشن سلوشن سپلیمنٹ پیک الگ سے خریدے جا سکتے ہیں، تفصیلات کے لیے ضمیمہ 1 (صفحہ 13) میں۔

آپریشن گائیڈ

A: نمونہ آر این اے ریلیز

1.خلیوں کا پہلے سے علاج کیا گیا: سیل کلچر پلیٹ کو ٹھنڈے پی بی ایس سے دھوئیں، پھر خلیات کو لیس کریں (10-10⁶)، 10⁶ خلیوں کی مقدار سے زیادہ، RNA نکالنے اور صاف کرنے کے لیے Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) یا Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) تجویز کی جاتی ہے۔

1.1منسلک خلیات (مثال کے طور پر 24- اچھی پلیٹ)

1.1.1ہر کنویں میں خلیوں کی تعداد کا تعین کریں، معلوم کریں کہ خلیوں کی تعداد 1 × 10 ہے۔⁵، اور کلچر ڈش سے کلچر میڈیم کو ہٹانے کے لیے پائپیٹ کا استعمال کریں۔

1.1.2ہر کنویں میں 200 μl پری ٹھنڈا 1 × PBS شامل کریں۔بار بار پائپ نہ لگائیں اور پی بی ایس کو کنوؤں سے نہ نکالیں۔پلیٹ کو جھکائیں اور زیادہ سے زیادہ پی بی ایس کو ہٹا دیں۔مرحلہ 2 پر آگے بڑھیں۔

1.1.3سیل کلچر ڈش میں مختلف سیل کلچر ڈش یا ریفرنس نمبر ٹیبل 1-1 سیل واشنگ کے لیے پری کولڈ 1 × PBS شامل کیا گیا تھا۔

جدول 1-1: خلیات کی مختلف تعداد کے لیے پی بی ایس کی خوراک

نوٹ：ایک مضبوط پیروکار خلیات کو یقینی بنانے کے لئے,سیل نقصان کی ایک بڑی تعداد کو دھونے سے گریز کیا .

1.2معطلی کے خلیات یا غیر غیر محفوظ پلیٹوں میں مہذب خلیات

1.2.1غیر ملٹی کنواں پلیٹوں میں کلچر کیے جانے والے ایڈورنٹ سیلز (معطلی سیل اگلے مرحلے 1.2.2 سے شروع ہوتے ہیں)، سیل کو جمع کرنے کے عام طریقہ کے مطابق سیلز کو اکٹھا کریں اور الگ کریں، اور انہیں کلچر پلیٹ یا سینٹری فیوج ٹیوب میں رکھیں؛اگر ٹرپسنائزیشن کا استعمال کیا جاتا ہے تو، خلیات کو جمع کرنے اور بقایا ٹرپسن کو ہٹانے کے لیے سینٹرفیوگریشن کی ضرورت ہوتی ہے، خلیات کو منتشر کرنے کے لیے PBS کے دوبارہ معطل شدہ خلیوں کو انفرادی خلیات میں شامل کیا جاتا ہے۔

1.2.2خلیات کی تعداد کے بعد، aliquoted خلیات 1×10⁵ ایک سے سینٹری فیوج ٹیوبوں تک، 10 منٹ کے لیے 1000 × g پر سینٹرفیوگریشن کے ذریعے سیل جمع کریں۔

1.2.3سینٹری فیوج ٹیوب میں 200 μl PBS شامل کریں، بار بار پائپ نہ لگائیں، اور براہ راست PBS کی خواہش کریں۔مرحلہ 2 کی طرف بڑھیں۔

2.Cell lysis: Buffer CL کو ہٹا دیں، اس کا درجہ حرارت کمرے کے درجہ حرارت کے مطابق، DNA Eraser اور Foregene Protease Plus II، درج ذیل ٹیبل 1-2 کے تیار کردہ lysis سسٹم کے مطابق: (Lysis سلوشن استعمال کے لیے تیار ہے)۔

جدول 1-2: درار نظام کی تیاری (نوٹ: برف پر تیاری میں)

3.( مثال کے طور پر 24-ویل پلیٹ) ہر کنویں میں 200 μl سیل لیسس ماسٹر مکس کریں، بار بار 5-10 بار پھونکیں، کمرے کے درجہ حرارت (20-25 ℃) پر 5 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔

نوٹ：بلبلوں کی تشکیل سے بچنے کے لیے، براہ کرم جب پائپٹنگ پائپیٹ اسکیل کو 200μl یا اس سے کم پر ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔lysis کے بعد خلیے ابر آلود دکھائی دے سکتے ہیں، جو کہ عام بات ہے۔

4. (مثال کے طور پر 24-well پلیٹ) مائع 20 μl بفر ایس ٹی میں شامل کیا جاتا ہے (ٹیبل 1-3 میں دکھائی گئی رقم میں مختلف لیسیز سسٹم بفر ایس ٹی شامل کیا گیا ہے)، 5-10 بار پائپٹنگ کو دہرایا جاتا ہے، کمرے کے درجہ حرارت پر (20-25 ℃) 2 منٹ تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔

نوٹ：پپیٹ کی نوک سطح کے نیچے نمٹا دی گئی، اس بات کو یقینی بناتے ہوئے کہ لیسیٹ کو شامل کیا گیا تھا۔,بلبلوں کی تشکیل سے بچنے کے لیے، براہ کرم جب پائپٹنگ پائپیٹ اسکیل کو 200μl یا اس سے کم پر ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔

جدول 1-3：بفر ایس ٹی شامل کریں۔

5. lysate کو بعد میں RT-qPCR تجربات کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔اگر بعد کے تجربات وقت پر نہیں کیے جا سکتے ہیں، تو براہ کرم اسے 2 گھنٹے سے زیادہ برف پر رکھیں، اور -20 ℃ یا -80 ℃ ( تین ماہ سے زیادہ نہیں) پر اسٹور کریں۔

B: RT نظام کی تیاری

1.5 × ڈائریکٹ RT مکس نکالیں اور اسے برف کے غسل پر رکھیں، اسے قدرتی طور پر پگھلنے دیں، اور بعد میں استعمال کے لیے آہستہ سے مکس کریں۔RNase-Free ddH2O نکالیں اور اسے پگھلائیں اور بعد میں استعمال کے لیے اسے برف کے غسل پر رکھیں۔نیچے دیے گئے جدول 2-1 کے مطابق برف پر ردعمل کا نظام تیار کریں۔

جدول 2-1: RT ری ایکشن سسٹم کی تیاری

2. نظام کی تشکیل کی تکمیل کے بعد، مندرجہ ذیل ٹیبل 2 -2 رد عمل کی شرائط RT ردعمل میں ہلکے سے ملایا گیا اور مختصر طور پر سینٹرفیوج کیا گیا۔

جدول 2-2: RT ری ایکشن کنڈیشن سیٹنگ

3. رد عمل کی تکمیل کے بعد، رد عمل کی مصنوعات کو براہ راست qPCR کے لیے برف پر رکھا گیا تھا، براہ کرم طویل مدتی تحفظ -20℃ یا -80℃ رکھیں۔

نوٹ: نان پیوریفائیڈ ٹیمپلیٹ کے استعمال کی وجہ سے، ریورس ٹرانسکرپشن پروڈکٹ میں سفید پریزیٹیٹ ظاہر ہو سکتے ہیں۔یہ ایک عام رجحان ہے۔بعد کے تجربات کے لیے فوری طور پر سپرنٹنٹ کو سینٹرفیوج کریں۔

نتیجے میں آنے والے RT ردعمل کے حل کو اگلے مرحلے کے ریئل ٹائم پی سی آر ری ایکشن سسٹم میں شامل کیا جاتا ہے، یہ سفارش کی جاتی ہے کہ ری ایکشن سسٹم کے 10-30% تک کی مقدار شامل کی جائے۔

C: کیو پی سی آر ری ایکشن سسٹم کی تیاری

1. رد عمل کا نظام تیار کرنے کے لیے درج ذیل جدول 3-1 کے مطابق سی ڈی این اے ٹیمپلیٹ میں تیار کردہ B کی مناسب مقدار۔

نوٹ: cDNA ٹیمپلیٹ کی مقدار qPCR سسٹم کا 10-30% ہے۔مثال کے طور پر، 20μl qPCR سسٹم میں، 2-6 μl lysis بفر شامل کریں، لیکن 6 μl سے زیادہ نہیں۔

2. کیو پی سی آر کے رد عمل کے لیے بہتر کیو پی سی آر حالات (اینیلنگ درجہ حرارت، وغیرہ) (ٹیبل 3-2 میں دی گئی رد عمل کی شرائط)۔

نوٹ: بہتر نتائج حاصل کرنے کے لیے qPCR کے رد عمل کے لیے موزوں حالات استعمال کرنے کی کوشش کریں۔

جدول 3-1: پی سی آر ری ایکشن سسٹم کی تیاری

1*: پرائمر کی ارتکاز کو 50-900 nM کی حد میں ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے جب پرائمر کے رد عمل کی کارکردگی خراب ہو۔

نوٹ: کیو پی سی آر سسٹم کو تجرباتی ضروریات اور فلوروسینس سائیکلر ماڈل کے مطابق ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔50 میں کیو پی سی آر کے لیےμl سسٹم، 20 کے مطابق تناسب سے ری ایجنٹ کی خوراک کو ایڈجسٹ کریں۔μl نظام.

2*: فلوروسینس مقداری تھرمل سائیکلر کے مطابق ROX ریفرنس ڈائی کی مناسب حتمی ارتکاز کا انتخاب کریں۔عام فلوروسینس مقداری سائیکلرز کے لیے سب سے زیادہ مناسب ROX حوالہ ڈائی ارتکاز ذیل کے جدول میں دکھایا گیا ہے:

جدول 3-2: qPCR ردعمل کی شرائط فراہم کی گئی ہیں۔

نوٹ: بہترین qPCR اثر حاصل کرنے کے لیے، گریڈینٹ PCR کو مختلف ٹیمپلیٹس اور مختلف پرائمر کے لیے رد عمل کے حالات کو بہتر بنانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔PCR رد عمل کی شرائط فلوروسینس تجزیہ کار، ٹیمپلیٹ، پرائمر وغیرہ کے لحاظ سے مختلف ہوتی ہیں۔ مخصوص آپریشن میں، بہترین رد عمل کے حالات کو فلوروسینس مقداری تھرمل سائکلر، ٹیمپلیٹ کی قسم، دلچسپی کے ٹکڑے کا سائز، ایمپلیفائیڈ ری ایکشن کا بنیادی ترتیب، درجہ حرارت کے ٹکڑوں کی لمبائی اور پرائمر ری ایکشن کا وقت، درجہ حرارت وغیرہ کی مخصوص حالتوں کے مطابق ڈیزائن کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔

ریئل ٹائم پی سی آر پرائمر ڈیزائن کے اصول

فارورڈ پرائمر اور ریورس پرائمر

ریئل ٹائم پی سی آر کے لیے، پرائمر ڈیزائن بہت اہم ہے۔پرائمر کا تعلق پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی خاصیت اور کارکردگی سے ہے، اور اسے درج ذیل اصولوں کے حوالے سے ڈیزائن کیا جا سکتا ہے۔

◆ پرائمر کی لمبائی: 18-30bp۔

◆ GC مواد: 40-60%۔

◆ Tm قدر: پرائمر ڈیزائن سافٹ ویئر، جیسے پرائمر 5، پرائمر کی Tm قدر دے سکتا ہے۔اپ اسٹریم اور ڈاون اسٹریم پرائمر کی Tm قدریں زیادہ سے زیادہ قریب ہونی چاہئیں۔Tm حساب کا فارمولا بھی استعمال کیا جا سکتا ہے: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T)۔PCR کو انجام دیتے وقت، 5 °C کی پرائمر Tm قدر سے کم درجہ حرارت کو عام طور پر اینیلنگ درجہ حرارت کے طور پر منتخب کیا جاتا ہے (اینیلنگ درجہ حرارت میں اسی طرح کا اضافہ PCR ردعمل کی خصوصیت کو بڑھا سکتا ہے)۔

◆ پرائمر اور پی سی آر مصنوعات:

◆ ڈیزائن پرائمر پی سی آر ایمپلیفیکیشن مصنوعات کی لمبائی ترجیحاً 100-150bp ہے۔

◆ ٹیمپلیٹ کے ثانوی ساختی علاقے میں ڈیزائن پرائمر سے جہاں تک ممکن ہو گریز کیا جانا چاہیے۔

◆ اپ اسٹریم اور ڈاون اسٹریم پرائمر کے 3′ سروں کے درمیان 2 یا زیادہ تکمیلی بنیادوں کی تشکیل سے گریز کریں۔

◆ پرائمر 3′ ٹرمینل بیس 3 اضافی مسلسل G یا C کے ساتھ موجود نہیں ہو سکتا۔

◆ پرائمر خود تکمیلی ڈھانچے نہیں رکھ سکتے، بصورت دیگر ہیئر پین کا ڈھانچہ بن جائے گا، جس سے پی سی آر ایمپلیفیکیشن متاثر ہوگا۔

◆ ATCG کو پرائمر کی ترتیب میں جتنا ممکن ہو یکساں طور پر تقسیم کیا جانا چاہیے، اور 3′ ٹرمینل بیس کو T کے طور پر گریز کرنا چاہیے۔

اپینڈکس1：Cبراہ راستRT-qPCR کٹ کا جزوٹی سپلیمنٹ پیک

1. سیل لیسس حل