پائپیٹ ٹپس اور EP ٹیوبوں وغیرہ کی جراثیم کشی

1. deionized پانی کے ساتھ 0.1% (ایک ہزارواں) DEPC (انتہائی زہریلا مادہ) تیار کریں، اسے فوم ہڈ میں احتیاط سے استعمال کریں، اور اسے روشنی سے دور 4°C پر رکھیں؛

DEPC پانی خالص پانی ہے جسے DEPC کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے اور اعلی درجہ حرارت اور ہائی پریشر سے جراثیم سے پاک کیا جاتا ہے۔RNase، DNase اور proteinase سے پاک ہونے کے لیے ٹیسٹ کیا گیا۔

2. پائپٹ کی نوک اور EP ٹیوب کو 0.1% DEPC میں ڈالیں، اور یقینی بنائیں کہ پائپٹ کی نوک اور EP ٹیوب 0.1% DEP سے بھری ہوئی ہیں۔

3. روشنی سے بچائیں، کھڑے رہنے دیں، راتوں رات (12-24h)

4. ٹپ اور EP ٹیوب پر مشتمل باکس کو DEPC میں بھگانے کی ضرورت نہیں ہے۔DEPC پانی کو نوک یا EP ٹیوب میں تقریباً نکالنے کے بعد، اسے پیک کریں اور اسے لپیٹ دیں۔

5. 121 ڈگری سیلسیس، 30 منٹ

6. 180 ڈگری سیلسیس، کئی گھنٹوں تک خشک (کم از کم 3 گھنٹے)

نوٹ: اے۔DEPC کو سنبھالتے وقت لیٹیکس دستانے اور ماسک پہنیں!b، یا DEPC نس بندی کے بغیر، 130 ℃، 90 منٹ آٹوکلیو (کئی لیبارٹریوں میں دو بار ہائی درجہ حرارت نس بندی)

آر این اے نکالنے کے تحفظات

ٹشو آر این اے تنہائی کی ناکامی کے دو بڑے مظاہر

آر این اے کی تنزلی اور بافتوں میں نجاست کی باقیات،انحطاط کے حوالے سے، آئیے پہلے دیکھتے ہیں کہ مہذب خلیوں سے نکالا جانے والا آر این اے آسانی سے انحطاط کیوں نہیں ہوتا۔موجودہ RNA نکالنے والے ریجنٹس میں تمام اجزاء ہوتے ہیں جو RNase کو تیزی سے روکتے ہیں۔کلچرڈ سیلز میں lysate شامل کریں، اور اسے صرف مکس کریں، تمام سیلز کو lysate کے ساتھ اچھی طرح ملایا جا سکتا ہے، اور سیل مکمل طور پر لیس ہو جاتے ہیں۔خلیوں کے لیس ہونے کے بعد، lysate میں موجود فعال اجزاء فوری طور پر انٹرا سیلولر RNase کو روکتے ہیں، اس لیے RNA برقرار رہتا ہے۔کہنے کا مطلب یہ ہے کہ چونکہ مہذب خلیات آسانی سے اور مکمل طور پر لیسیٹ کے ساتھ رابطے میں رہتے ہیں، ان کا آر این اے آسانی سے کم نہیں ہوتا ہے۔دوسری طرف، بافتوں میں آر این اے آسانی سے تنزلی کا شکار ہو جاتا ہے کیونکہ بافتوں میں موجود خلیات لیسیٹ سے جلدی رابطہ کرنا آسان نہیں ہوتے۔کافی رابطے کی وجہ سے۔تو،یہ فرض کرتے ہوئے کہ آر این اے کی سرگرمی کو روکتے ہوئے ٹشو کو ایک خلیے میں تبدیل کرنے کا کوئی طریقہ موجود ہے، انحطاط کا مسئلہ مکمل طور پر حل ہو سکتا ہے۔

مائع نائٹروجن ملنگ اس طرح کا سب سے مؤثر طریقہ ہے۔تاہم، مائع نائٹروجن کی گھسائی کرنے کا طریقہ بہت مشکل ہے، خاص طور پر جب نمونوں کی تعداد زیادہ ہو۔اس نے اگلی بہترین چیز کو جنم دیا: homogenizer۔دیhomogenizerطریقہ اس سوال پر غور نہیں کرتا ہے کہ سیلز کے lysate کے ساتھ رابطہ ہونے سے پہلے RNase کی سرگرمی کو کیسے روکا جاتا ہے، بلکہ یہ دعا کرتا ہے کہ بافتوں میں خلل کی شرح اس شرح سے زیادہ تیز ہو جس پر انٹرا سیلولر RNase RN کو کم کرتا ہے۔

الیکٹرک ہوموجنائزر کا اثر بہتر ہے،اور گلاس ہوموجنائزر کا اثر ناقص ہے، لیکن عام طور پر، ہوموجنائزر کا طریقہ انحطاط کے رجحان کو نہیں روک سکتا۔لہٰذا، اگر نکالنے کو کم کیا جاتا ہے، تو اصل الیکٹرک ہوموجنائزر کو مائع نائٹروجن کے ساتھ پیسنے کے لیے استعمال کیا جانا چاہیے۔اصل شیشے کے ہوموجنائزر کو برقی ہوموجنائزر میں تبدیل کیا جانا چاہئے یا مائع نائٹروجن کے ساتھ براہ راست مل جانا چاہئے۔مسئلہ تقریباً 100% قابل عمل ہے۔حل ہو جاؤ.

نجاست کی باقیات کا مسئلہ جو بعد کے تجربات کو متاثر کرتا ہے اس کی تنزلی سے زیادہ متنوع وجوہات ہیں، اور حل بھی اسی طرح مختلف ہیں۔آخر میں،اگر ٹشو میں انحطاط یا بقایا نجاست ہے تو، مخصوص تجرباتی مواد کے لیے نکالنے کا طریقہ/ریجنٹ کو بہتر بنایا جانا چاہیے۔آپ کو اصلاح کے لیے اپنے قیمتی نمونے استعمال کرنے کی ضرورت نہیں ہے: آپ بازار سے کچھ چھوٹے جانور جیسے مچھلی/مرغی خرید سکتے ہیں، آر این اے نکالنے کے لیے مواد کا متعلقہ حصہ لے سکتے ہیں، اور دوسرا حصہ پروٹین نکالنے کے لیے - منہ، پیٹ اور آنتوں کے عرق سے پیس سکتے ہیں۔

نکالے گئے RNA کا ہدف RNA مختلف فالو اپ تجربات کے لیے استعمال ہوتا ہے، اور اس کے معیار کے تقاضے مختلف ہوتے ہیں۔

cDNA لائبریری کی تعمیر کے لیے RNA کی سالمیت کی ضرورت ہوتی ہے بغیر انزائم ری ایکشن روکنے والوں کی باقیات کے۔شمالی کو اعلی آر این اے کی سالمیت اور انزائم ری ایکشن روکنے والوں کی باقیات کے لیے کم ضروریات کی ضرورت ہوتی ہے۔RT-PCR کو بہت زیادہ RNA سالمیت کی ضرورت نہیں ہے،لیکن انزائم کے رد عمل کو روکتا ہے۔باقیات کی ضروریات سخت ہیں۔ان پٹ آؤٹ پٹ کا تعین کرتا ہے۔ہر بار جب مقصد سب سے زیادہ پاکیزگی کا RNA حاصل کرنا ہوتا ہے، تو اس میں لوگوں اور پیسے کی لاگت آئے گی۔

نمونوں کا مجموعہ/ذخیرہ

انحطاط کو متاثر کرنے والے عوامل نمونے کے زندہ جسم/یا اصل نشوونما کے ماحول سے نکل جانے کے بعد، نمونے میں موجود اینڈوجینس انزائمز RNA کو کم کرنا شروع کر دیں گے،اور انحطاط کی شرح کا تعلق اینڈوجینس انزائمز اور درجہ حرارت سے ہے۔روایتی طور پر، endogenous enzyme کی سرگرمی کو مکمل طور پر روکنے کے صرف دو طریقے ہیں: فوری طور پر lysate شامل کریں اور اچھی طرح اور تیزی سے ہم آہنگ کریں۔چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹ لیں اور فوری طور پر مائع نائٹروجن میں جم جائیں۔دونوں طریقوں کو تیز آپریشن کی ضرورت ہوتی ہے۔مؤخر الذکر تمام نمونوں کے لیے موزوں ہے، جب کہ سابقہ ​​صرف ان بافتوں کے لیے موزوں ہے جن میں خلیات اور اینڈوجینس انزائمز کم ہوتے ہیں اور ہم آہنگ کرنا آسان ہے۔خاص طور پر، پودوں کے ٹشو، جگر، تھیمس، لبلبہ، تلی، دماغ، چربی، پٹھوں کے ٹشو وغیرہ کو آگے بڑھنے سے پہلے مائع نائٹروجن کے ساتھ بہترین طور پر منجمد کیا جاتا ہے۔

نمونوں کی تقسیم اور ہم آہنگی۔

انحطاط اور پیداوار کو متاثر کرنے والے عوامل نمونے کا ٹکڑا ہے۔مکمل ہم آہنگی کے لیےجو کہ آر این اے کی مکمل اور مکمل رہائی کے لیے ہے۔خلیوں کو ٹوٹے بغیر براہ راست ہم آہنگ کیا جاسکتا ہے۔ٹشوز کو ٹوٹنے کے بعد ہی ہم آہنگ کیا جاسکتا ہے۔خمیر اور بیکٹیریا کو ہم آہنگ کرنے سے پہلے ان کو متعلقہ خامروں سے توڑنا ضروری ہے۔نچلے اینڈوجینس انزائم کے مواد اور آسانی سے ہم آہنگی والے ٹشوز کو ایک وقت میں لیسیٹ میں ہوموجنائزر کے ذریعے کچل کر ہم آہنگ کیا جا سکتا ہے۔پودوں کے ٹشو، جگر، تھیمس، لبلبہ، تلی، دماغ، چربی، پٹھوں کے ٹشو اور دیگر نمونے، ان میں یا تو اینڈوجینس انزائمز زیادہ ہوتے ہیں یا آسانی سے ہم آہنگ نہیں ہوتے،لہذا ٹشو میں خلل اور ہوموجنائزیشن کو الگ سے انجام دیا جانا چاہئے۔.فریگمنٹیشن کا سب سے قابل اعتماد اور سب سے زیادہ نتیجہ خیز طریقہ مائع نائٹروجن کے ساتھ ملنگ ہے، اور ہوموجنائزیشن کا سب سے قابل اعتماد طریقہ الیکٹرک ہوموجنائزر کا استعمال ہے۔مائع نائٹروجن کے ساتھ گھسائی کرنے کے بارے میں ایک خاص نوٹ: نمونے کو پورے گھسائی کے عمل کے دوران پگھلایا نہیں جانا چاہیے، کیونکہ منجمد ہونے پر اینڈوجینس انزائمز کے کام کرنے کا زیادہ امکان ہوتا ہے۔

لائسیٹ کا انتخاب

آپریشن کی سہولت اور بقایا endogenous نجاست کے عوامل کو متاثر کرنا عام طور پر استعمال ہونے والے lysis محلول RNase کی سرگرمی کو تقریباً روک سکتے ہیں۔لہذا، ایک lysis حل کو منتخب کرنے کے اہم نکتے کو صاف کرنے کے طریقہ کار کے ساتھ مل کر غور کرنا ہے.ایک استثناء ہے:اعلی endogenous enzyme مواد والے نمونوں کو اینڈوجینس انزائمز کو غیر فعال کرنے کی صلاحیت کو بڑھانے کے لیے فینول پر مشتمل lysate استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

طہارت کے طریقہ کار کا انتخاب

وہ عوامل جو بقایا endogenous نجاستوں کو متاثر کرتے ہیں، نکالنے کی رفتار صاف نمونوں جیسے کہ خلیات کے لیے، تقریباً کسی بھی طہارت کے طریقہ کار سے تسلی بخش نتائج حاصل کیے جا سکتے ہیں۔لیکن بہت سے دوسرے نمونوں کے لیے، خاص طور پر وہ جن میں نجاست کی زیادہ مقدار ہوتی ہے جیسے کہ پودے، جگر، بیکٹیریا وغیرہ، مناسب طہارت کا طریقہ منتخب کرنا بہت ضروری ہے۔کالم سینٹری فیوگل پیوریفیکیشن کے طریقہ کار میں نکالنے کی تیز رفتار ہوتی ہے اور یہ مؤثر طریقے سے نجاست کو دور کر سکتا ہے جو RNA کے بعد کے انزیمیٹک ردعمل کو متاثر کرتی ہیں، لیکن یہ مہنگا ہےیہاں);صاف کرنے کے معاشی اور کلاسک طریقے استعمال کرتے ہوئے، جیسے LiCl ورن، بھی تسلی بخش نتائج حاصل کر سکتے ہیں، لیکن آپریشن کا وقت طویل ہے۔.

آر این اے نکالنے کے لیے "تین مضامین اور آٹھ توجہ"

نظم 1:خارجی خامروں کی آلودگی کو ختم کریں۔

نوٹ 1:سختی سے ماسک اور دستانے پہنیں۔

نوٹ 2:تجربے میں شامل سینٹری فیوج ٹیوبیں، ٹپ ہیڈز، پائپیٹ راڈز، الیکٹروفورسس ٹینک، اور تجرباتی بنچوں کو اچھی طرح سے ٹھکانے لگا دینا چاہیے۔

نوٹ 3:تجربے میں شامل ری ایجنٹس/حل، خاص طور پر پانی، RNase سے پاک ہونا چاہیے۔

نظم 2:endogenous خامروں کی سرگرمی کو مسدود کریں۔

نوٹ 4:مناسب ہم آہنگی کا طریقہ منتخب کریں۔

نوٹ 5:مناسب لیسیٹ کا انتخاب کریں۔

نوٹ 6:نمونے کی ابتدائی مقدار کو کنٹرول کریں۔

نظم 3:اپنے نکالنے کا مقصد واضح کریں۔

نوٹ 7:کسی بھی لیسیٹ سسٹم کے نمونے کی زیادہ سے زیادہ ابتدائی مقدار تک پہنچنے کے ساتھ، نکالنے کی کامیابی کی شرح تیزی سے گر جاتی ہے۔

نوٹ 8:کامیاب RNA نکالنے کا واحد معاشی معیار بعد کے تجربات میں کامیابی ہے، پیداوار نہیں۔

RNase آلودگی کے سرفہرست 10 ذرائع

1. انگلیاں خارجی خامروں کا پہلا ذریعہ ہیں، اس لیے دستانے پہننے اور بار بار تبدیل کرنے چاہییں۔اس کے علاوہ ماسک بھی ضرور پہننا چاہیے کیونکہ سانس لینا بھی خامروں کا ایک اہم ذریعہ ہے۔دستانے کا ماسک پہننے کا ایک اضافی فائدہ تجربہ کار کی حفاظت کرنا ہے۔

2. پپیٹ ٹپس، سینٹری فیوج ٹیوبیں، پائپیٹس - RNase کو اکیلے نس بندی سے غیر فعال نہیں کیا جاسکتا، اس لیے پائپیٹ ٹپس اور سینٹری فیوج ٹیوبوں کا علاج DEPC کے ساتھ کیا جانا چاہیے، چاہے وہ DEPC کے علاج کے طور پر نشان زد ہوں۔خاص مقصد کے پائپیٹ کا استعمال کرنا بہتر ہے، استعمال کرنے سے پہلے اسے 75% الکحل والی روئی کی گیند سے صاف کریں، خاص طور پر چھڑی؛اس کے علاوہ، اس بات کو یقینی بنائیں کہ ہیڈ ریموور استعمال نہ کریں۔

3. پانی/بفر RNase آلودگی سے پاک ہونا چاہیے۔

4. کم از کم ٹیسٹ ٹیبل کو 75% الکحل کاٹن بالز سے صاف کرنا چاہیے۔

5.Endogenous RNase تمام ٹشوز میں اینڈوجینس انزائمز ہوتے ہیں، لہذا مائع نائٹروجن کے ساتھ ٹشوز کو فوری منجمد کرنا انحطاط کو کم کرنے کا بہترین طریقہ ہے۔مائع نائٹروجن کو ذخیرہ کرنے/پیسنے کا طریقہ بے شک تکلیف دہ ہے، لیکن یہ ان بافتوں کے لیے واحد راستہ ہے جن میں endogenous خامروں کی اعلی سطح ہوتی ہے۔

6. RNA نمونے RNA نکالنے والی مصنوعات میں RNase آلودگی کے نشانات ہو سکتے ہیں۔

7. پلاسمڈ نکالنا پلاسمڈ نکالنا اکثر RNA کو کم کرنے کے لیے Rnase کا استعمال کرتا ہے، اور بقایا Rnase کو Proteinase K کے ساتھ ہضم کیا جانا چاہیے اور PCI کے ذریعے نکالا جانا چاہیے۔

8. RNA سٹوریج یہاں تک کہ اگر اسے کم درجہ حرارت پر ذخیرہ کیا جاتا ہے، RNase کی ٹریس مقدار RNA کی تنزلی کا سبب بنے گی۔آر این اے کے طویل مدتی تحفظ کا بہترین حل نمک/الکوحل سسپشن ہے، کیونکہ الکحل کم درجہ حرارت پر تمام انزیمیٹک سرگرمیوں کو روکتا ہے۔

9. جب کیشنز (Ca, Mg) میں یہ آئنز ہوتے ہیں، تو 80C پر 5 منٹ تک گرم کرنے سے RNA کلیو ہو جائے گا، اس لیے اگر RNA کو گرم کرنے کی ضرورت ہے، تو تحفظ کے محلول میں چیلیٹنگ ایجنٹ (1mM سوڈیم سائٹریٹ، pH 6.4) ہونا ضروری ہے۔

10. بعد کے تجربات میں استعمال ہونے والے انزائمز RNase سے آلودہ ہو سکتے ہیں۔

RNA نکالنے کے لیے 10 نکات

1: RNase سرگرمی کو جلدی سے روکیں۔نمونے جمع کرنے کے بعد جلدی سے منجمد ہو جاتے ہیں، اور RNase کو lysis کے دوران تیز رفتار آپریشن سے غیر فعال کر دیا جاتا ہے۔

2: زیادہ رائبوزائم مواد والے بافتوں کے لیے ایک مناسب نکالنے کا طریقہ منتخب کریں، اور فینول پر مشتمل طریقہ استعمال کرنے کے لیے ایڈیپوز ٹشو بہترین ہے۔

3: پیشین گوئی کے معیار کے لیے ناردرن کی ضرورت ہوتی ہے، cDNA لائبریری کی تعمیر کے لیے اعلیٰ سالمیت کی ضرورت ہوتی ہے، اور RT-PCR اور RPA (Ribonuclease Protection Asay) کو اعلیٰ دیانت داری کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔RT-PCR کو اعلی پاکیزگی کی ضرورت ہوتی ہے (انزائم روکنے والے باقیات)۔

4: مکمل ہم آہنگی پیداوار کو بہتر بنانے اور تنزلی کو کم کرنے کی کلید ہے۔

5: RNA الیکٹروفورسس کا پتہ لگانے کی سالمیت کو چیک کریں، 28S: 18S = 2:1 ایک مکمل علامت ہے، 1:1 زیادہ تر تجربات کے لیے بھی قابل قبول ہے۔

6: RT-PCR کے لیے DNA کو ہٹانا، array analysis DNA کو ہٹانے کے لیے Dnase I کا استعمال کرنا بہتر ہے۔

7: خارجی خامروں کی آلودگی کو کم کریں - خامروں کو باہر سے درآمد نہیں کیا جا سکتا۔

8: کم ارتکاز والے نیوکلک ایسڈ کو مرتکز کرتے وقت، ایک کو-پریسیپیٹیشن ریجنٹ شامل کیا جانا چاہیے۔لیکن انزائمز اور ڈی این اے کی آلودگی پر مشتمل کو-پریسیپیٹنٹ کو روکنے کے لیے۔

9: آر این اے کو اچھی طرح سے تحلیل کریں، اگر ضروری ہو تو، 65C پر 5 منٹ تک گرم کریں۔

مناسب ذخیرہ کرنے کا طریقہ

اسے -20C پر تھوڑے وقت کے لیے، اور -80C پر طویل عرصے کے لیے ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔RNA کی پیداوار کو بہتر بنانے کا پہلا قدم یہ سمجھنا ہے کہ مختلف نمونوں کے RNA کا مواد بہت مختلف ہوتا ہے۔زیادہ کثرت (2-4ug/mg) جیسے جگر، لبلبہ، دل، درمیانی کثرت (0.05-2ug/mg) جیسے دماغ، ایمبریو، گردے، پھیپھڑوں، thymus، ovary، کم کثرت (<0.05ug/mg) mg) جیسے مثانہ، ہڈی، چربی۔

1: RN کو جاری کرنے کے لیے Lyse خلیات - اگر RNA جاری نہیں کیا جاتا ہے، تو پیداوار کم ہو جائے گی۔الیکٹرک ہوموجنائزیشن دوسرے ہم آہنگی کے طریقوں سے بہتر کام کرتی ہے، لیکن اسے دوسرے طریقوں کے ساتھ جوڑنے کی بھی ضرورت پڑسکتی ہے، جیسے مائع نائٹروجن میشنگ، انزیمیٹک ہاضمہ (لائیسوزیم/لائیٹیکیس)

2: نکالنے کے طریقہ کار کی اصلاح۔فینول پر مبنی طریقوں کے ساتھ سب سے بڑی پریشانی نامکمل سطح بندی اور جزوی آر این اے کا نقصان ہے (سپرناٹینٹ کو مکمل طور پر نہیں ہٹایا جا سکتا)۔نامکمل اسٹریٹیفکیشن نیوکلک ایسڈ اور پروٹین کے اعلیٰ مواد کی وجہ سے ہے، جسے استعمال شدہ لیسیٹ کی مقدار کو بڑھا کر یا نمونے کی مقدار کو کم کر کے حل کیا جا سکتا ہے۔کلوروفارم نکالنے کا ایک مرحلہ ایڈیپوز ٹشو میں شامل کیا گیا تھا۔آر این اے کے نقصان کو بیک پمپنگ کے ذریعے یا سینٹرفیوگریشن کے بعد نامیاتی تہہ کو ہٹا کر کم کیا جا سکتا ہے۔کالم سینٹرفیوگریشن پر مبنی طریقوں کا سب سے بڑا مسئلہ اضافی نمونہ ہے۔

کلاسیکی نکالنے کے نکات

1. فینول پیوریفیکیشن: 1:1 فینول/کلوروفارم کا مساوی حجم شامل کریں اور 1-2 منٹ کے لیے بھرپور طریقے سے مکس کریں۔2 منٹ کے لیے تیز رفتاری سے سینٹرفیوج کریں۔احتیاط سے سپرنٹنٹ (80-90٪) کو ہٹا دیں۔درمیانی تہہ تک کبھی نہ پہنچیں۔فینول/کلوروفارم میں رد عمل کے حل کی مساوی مقدار شامل کی جا سکتی ہے اور سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا جا سکتا ہے۔پیداوار کو بہتر بنانے کے لیے نیوکلک ایسڈ کی بارش کے لیے دونوں سپرنٹنٹس کو ایک ساتھ ملایا جا سکتا ہے۔اختلاط کرتے وقت زیادہ نرم نہ بنیں، اور تمام سپرنٹنٹ کو ہٹانے کی کوشش نہ کریں۔

2. 70-80٪ ایتھنول کے ساتھ دھونا: دھونے کے دوران، نیوکلک ایسڈ کو معطل کرنا ضروری ہے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ بقایا نمک دھل جائے۔اسی وقت، ایتھنول ڈالنے کے فوراً بعد، چند سیکنڈ کے لیے تیز رفتاری سے سینٹری فیوج کریں، اور پھر بقایا ایتھنول کو پائپیٹ سے ہٹا دیں۔کمرے کے درجہ حرارت پر 5-10 منٹ تک کھڑے ہونے کے بعد تحلیل کریں۔

11. خصوصی تنظیموں کا اخراج

1. ریشے دار ٹشو: ریشے دار ٹشو سے آر این اے نکالنے کی کلید جیسے دل/کنکال کے پٹھوں کو مکمل طور پر خلل ڈالنا ہے۔ان ٹشوز میں خلیے کی کثافت کم ہوتی ہے، اس لیے ٹشو کے فی یونٹ وزن میں RNA کی مقدار کم ہوتی ہے، اور یہ بہتر ہے کہ زیادہ سے زیادہ ابتدائی مقدار کا استعمال کیا جائے۔منجمد حالات میں ٹشو کو اچھی طرح پیسنا یقینی بنائیں۔

2. زیادہ پروٹین/چربی مواد کے ساتھ ٹشوز: دماغ/سبزیوں میں چربی کی مقدار زیادہ ہے۔پی سی آئی نکالنے کے بعد، سپرنٹنٹ میں سفید فلوکولس ہوتے ہیں۔سپرنٹنٹ کو کلوروفارم کے ساتھ دوبارہ نکالا جانا چاہیے۔

3. زیادہ نیوکلک ایسڈ/رائبوزائم مواد کے ساتھ ٹشوز: تلی/تھائمس میں نیوکلک ایسڈ اور رائبوزائم مواد زیادہ ہوتا ہے۔منجمد ہونے والی حالتوں میں ٹشو کو پیسنا اور اس کے بعد تیزی سے ہم آہنگی رائبوزائمز کو مؤثر طریقے سے غیر فعال کر سکتی ہے۔تاہم، اگر lysate بہت زیادہ چپچپا ہے (اعلیٰ نیوکلک ایسڈ مواد کی وجہ سے)، PCI نکالنا مؤثر طریقے سے استحکام نہیں کر سکے گا؛مزید lysate شامل کرنے سے یہ مسئلہ حل ہو سکتا ہے۔ایک سے زیادہ PCI نکالنے سے زیادہ بقایا ڈی این اے کو ہٹایا جا سکتا ہے۔اگر الکحل شامل کرنے کے فوراً بعد سفید رنگ کا رنگ بنتا ہے تو یہ ڈی این اے کی آلودگی کی نشاندہی کرتا ہے۔تحلیل کے بعد تیزابی پی سی آئی کے ساتھ دوبارہ نکالنے سے ڈی این اے کی آلودگی دور ہو سکتی ہے۔

4. پلانٹ ٹشو: پودوں کے ٹشو جانوروں کے بافتوں سے زیادہ پیچیدہ ہوتے ہیں۔عام طور پر، پودے مائع نائٹروجن حالات میں زمین پر ہوتے ہیں، اس لیے اینڈوجینس انزائمز کے ذریعے آر این اے کا انحطاط غیر معمولی ہے۔اگر انحطاط کا مسئلہ حل نہیں ہوتا ہے، تو یہ تقریباً یقینی طور پر نمونے میں موجود نجاست کی وجہ سے ہوتا ہے۔بہت سے پودوں میں موجود نجاست باقیات کا باعث بنتی ہے، اور باقیات کی وجہ اکثر یہ ہوتی ہے کہ یہ نجاست آر این اے کے ساتھ کچھ مماثلتیں رکھتی ہیں: آپ پریزیٹیٹ اور میں پریپییٹیٹ، اور آپ جذب کرتے ہیں اور میں جذب کرتا ہوں۔یہ خصوصیات اس بات کا تعین کرتی ہیں کہ وہ بہت مضبوط انزائم روکنے والے ہیں۔

فی الحال، تجارتی RNA نکالنے والے ریجنٹس کو چھوٹے ایڈجسٹمنٹ کے ساتھ تقریباً تمام جانوروں کے ٹشوز میں ڈھال لیا جا سکتا ہے، لیکن کچھ تجارتی RNA نکالنے والے ریجنٹس ہیں جو زیادہ تر پودوں کے ٹشوز کے لیے موزوں ہو سکتے ہیں۔خوش قسمتی سے، Foregene خصوصی فراہم کر سکتے ہیںپلانٹ آر این اے نکالنے کی کٹس، ہمارے پاس ہے۔پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ, پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ پلس.مؤخر الذکر خاص طور پر اعلی پولی سیکرائڈ اور پولیفینول مواد والے پودوں کے لئے ڈیزائن کیا گیا ہے۔RNA نکالنے کے لیے، لیب کے صارفین کی رائے خاص طور پر اچھی ہے۔

12. نمونے کے جمنے اور پگھلنے کا اثر منجمد نمونہ بڑا ہو سکتا ہے، اور اسے RNA نکالنے کے لیے استعمال کرنے سے پہلے کاٹنا ضروری ہے۔نمونے کاٹنے کے دوران پگھل جاتے ہیں (ممکنہ طور پر جزوی طور پر)۔RNA نکالنے سے پہلے منجمد نمونوں کا وزن کرنے کی ضرورت پڑسکتی ہے، اور اس عمل کے دوران پگھلنا یقینی طور پر ہوگا۔بعض اوقات، نمونے کا پگھلنا مائع نائٹروجن کی گھسائی کرنے کے عمل کے دوران بھی ہوتا ہے۔یا منجمد نمونہ مائع نائٹروجن ملنگ کے بغیر براہ راست لیسیٹ میں شامل کیا جاتا ہے، اور مکمل ہم آہنگی سے پہلے پگھلنا یقینی طور پر واقع ہوگا۔تجربات سے معلوم ہوا ہے کہ تازہ بافتوں کی نسبت منجمد ٹشو پگھلنے کے دوران RNA کے انحطاط کا زیادہ شکار ہوتے ہیں۔ممکنہ وجہ: منجمد پگھلنے کا عمل سیل کے اندر ڈھانچے میں خلل ڈالتا ہے، جس سے اینڈوجینس انزائمز کا RNA کے ساتھ براہ راست رابطہ میں آنا آسان ہوجاتا ہے۔

13. آر این اے کے معیار کا فیصلہ عام طور پر، الیکٹروفورسس کا استعمال آر این اے کی سالمیت کو جانچنے کے لیے کیا جاتا ہے، اور A260/A280 کا استعمال RNA کی پاکیزگی کا فیصلہ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔نظریہ میں، برقرار RNA کا تناسب 28S:18S = 2.7:1 ہے، اور زیادہ تر ڈیٹا 28S:18S = 2:1 کے تناسب پر زور دیتا ہے۔حقیقت یہ ہے کہ خلیوں کے علاوہ نمونوں سے نکالا گیا تقریباً کوئی بھی RNA 2:1 کے تناسب میں نہیں ہے (یہ Agilent Bioanalyzer کے ذریعے حاصل کیا گیا تھا)۔

RNA کے الیکٹروفورسس کے نتائج بہت سے عوامل سے متاثر ہوتے ہیں، بشمول ثانوی ساخت، الیکٹروفورسس کی شرائط، نمونے کا بوجھ، EB کی طرف سے سنترپتی کی ڈگری وغیرہ۔ RNA کا پتہ لگانے کے لیے مقامی الیکٹروفورسس کا استعمال کریں اور DNA مارکر کو بطور کنٹرول استعمال کریں۔اگر 2kb پر 28S اور 0.9kb پر 18S واضح ہیں، اور 28S: 18S > 1، سالمیت زیادہ تر بعد کے تجربات کی ضروریات کو پورا کر سکتی ہے۔

A260/A280 ایک انڈیکیٹر ہے جس نے بہت زیادہ الجھنیں پیدا کی ہیں۔سب سے پہلے، نیوکلک ایسڈ کے لیے اس اشارے کے اصل معنی کو واضح کرنا ضروری ہے: خالص RNA، اس کا A260/280 = تقریباً 2.0۔خالص RNA 'وجہ' ہے اور A260/A280 = 2 'اثر' ہے۔اب ہر کوئی A260/A280 کو 'وجہ' کے طور پر استعمال کر رہا ہے، یہ سوچ کر کہ "اگر A260/A280 = 2 ہے، تو RNA خالص ہے"، جو قدرتی طور پر الجھن کا باعث بنتا ہے۔

اگر آپ دلچسپی رکھتے ہیں تو، آپ اپنے RNA نمونے میں تھوڑا سا ریجنٹ شامل کر سکتے ہیں جو اکثر نکالنے میں استعمال ہوتا ہے، جیسے کہ فینول، گوانیڈائن آئسوتھیوسائنیٹ، پی ای جی، وغیرہ، اور پھر A260/A280 تناسب کی پیمائش کریں۔حقیقت یہ ہے کہ RNA نکالنے کے لیے استعمال ہونے والے بہت سے ری ایجنٹس، نیز نمونے میں بہت سی نجاست A260 اور A280 کے ارد گرد جذب ہو جاتے ہیں، جو A260/A280 کو متاثر کرتے ہیں۔

اس وقت سب سے سبق آموز طریقہ 200-300 nm رینج میں RNA کے نمونوں کو اسکین کرنا ہے۔خالص RNA کے وکر میں درج ذیل خصوصیات ہیں: وکر ہموار ہے، A230 اور A260 دو انفلیکشن پوائنٹس ہیں، A300 0 کے قریب ہے، A260/A280 = 2.0 کے قریب، اور A260/A230 = 2.0 کے قریب ہے۔اگر اسکین کا ڈیٹا دستیاب نہیں ہے تو، A260/A230 تناسب کا بھی تعین کیا جانا چاہیے، کیونکہ یہ تناسب انزائیمیٹک ردعمل کو متاثر کرنے والی تمام نجاستوں کو لے جانے کے لیے زیادہ حساس ہے۔آلے کی لکیری رینج (A260 کے لیے 0.1–0.5) کو مدنظر رکھیں۔

دو دیگر مفید مظاہر ہیں: جب پانی میں A260/A280 کی پیمائش کی جائے گی تو تناسب تقریباً 0.3 کم ہوگا۔جبکہ 10 mM EDTA میں ماپا جانے والا تناسب 1 mM EDTA میں ماپا جانے والے تناسب سے تقریباً 0.2 زیادہ ہے۔

متعلقہ مصنوعات:

چائنا پلانٹ ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ مینوفیکچرر اور سپلائر |فارجین (foreivd.com)

آر این اے آئسولیشن سیریز سپلائرز اور فیکٹری |چائنا آر این اے آئسولیشن سیریز مینوفیکچررز (foreivd.com)

RNA تنہائی سیریز - Foregene Co., Ltd (foreivd.com)