RT-qPCR کے تجربے میں RNA نکالنا اور معیار کی تشخیص، ریورس ٹرانسکرپشن اور qPCR تین مراحل شامل ہیں، ہر قدم میں بہت سی احتیاطیں ہیں، ہم ذیل میں تفصیل سے تعارف کرائیں گے۔

Ⅰآر این اے کے معیار کی تشخیص

RT-qPCR تجربے میں، RNA نکالنے کے مکمل ہونے کے بعد، RNA کے معیار کو جانچنے کی ضرورت ہے، اور فالو اپ تجربہ صرف اس کے اہل ہونے کے بعد ہی کیا جا سکتا ہے۔تشخیص کے طریقوں میں سپیکٹرو فوٹومیٹر، Agilent gel electrophoresis، Agilent 2100 analysis شامل ہیں، جن میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والے سپیکٹرو فوٹومیٹر اور agarose جیل الیکٹروفورسس طریقہ کا پتہ لگانا ہے۔واضح رہے کہ RNA کے ارتکاز، پاکیزگی اور سالمیت کا پتہ لگانے اور تجزیہ کرنے کے لیے ان دونوں طریقوں کو ایک ساتھ استعمال کرنے کی ضرورت ہے، تاکہ RNA کے معیار کو یقینی بنایا جا سکے۔

متعلقہ آر این اے آئسولیشن کٹ: 

سیل ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ

11 منٹ میں مختلف مہذب خلیوں سے انتہائی صاف اور اعلیٰ معیار کا کل RNA حاصل کیا جا سکتا ہے۔

جانوروں کی ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ

مختلف جانوروں کے بافتوں سے جلدی اور مؤثر طریقے سے اعلیٰ پاکیزگی اور اعلیٰ معیار کے کل RNA نکالیں۔

سپیکٹرو فوٹومیٹر:

سپیکٹرو فوٹومیٹر بنیادی طور پر آر این اے کے ارتکاز اور پاکیزگی کا تعین کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے، لیکن یہ آر این اے اور جینومک باقیات کی سالمیت کا پتہ نہیں لگا سکتا۔ان میں سے، A260/280 اور A260/230 RNA طہارت کا پتہ لگانے کے لیے اہم پیرامیٹرز ہیں، اور RNA کی پاکیزگی کو ان کی اقدار کے اتار چڑھاؤ کے مطابق معلوم کیا جا سکتا ہے:

1. 1.9< A260/280< 2.1، یہ بتاتا ہے کہ RNA کی پاکیزگی اچھی ہے؛A260/280<1.9، یہ بتاتا ہے کہ RNA میں پروٹین کی باقیات ہوسکتی ہیں؛A260/280>2.1، RNA کے ممکنہ جزوی انحطاط کی نشاندہی کرتا ہے، جس کی مزید تصدیق ایگرز جیل الیکٹروفورسس سے کی جا سکتی ہے۔

2. 2.0< A260/230< 2.2، اشارہ کرتا ہے کہ آر این اے کی پاکیزگی اچھی ہے۔A260/230< 2.0، یہ بتاتا ہے کہ RNA میں نامیاتی ریجنٹس کی باقیات ہو سکتی ہیں، جیسے فینول، ایتھنول یا شکر۔

ایگروز جیل الیکٹروفورسس:

Agarose جیل الیکٹروفورسس پرکھ RNA کی سالمیت، جینوم اور پروٹین کی باقیات کا تجزیہ کر سکتا ہے، لیکن RNA کے ارتکاز کو درست طریقے سے نہیں لگا سکتا یا نامیاتی ری ایجنٹس کی باقیات کا پتہ نہیں لگا سکتا۔مثال کے طور پر یوکریوٹک آر این اے ٹیمپلیٹس لیں:

1. آر این اے کو ایگروز جیل الیکٹروفورسس کا نشانہ بنایا گیا تھا۔اگر جیل کے نقشے پر 28sRNA، 18sRNA اور 5.8sRNA کے صرف تین سنگل بینڈ تھے، تو یہ ظاہر کرتا ہے کہ نکالا ہوا RNA برقرار ہے۔اگر کوئی گھسیٹنے والا رجحان ہے، تو یہ آر این اے کے جزوی تنزلی کی نشاندہی کرتا ہے۔

2. اگر گلو سوراخ اور 28sRNA بینڈ کے درمیان ایک ہی روشن بینڈ ہے، تو جینومک ڈی این اے کی باقیات ہوسکتی ہیں۔

3. اگر گوند کے سوراخ میں بینڈز نمودار ہوتے ہیں، تو یہ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ پروٹین اور دیگر میکرو مالیکولر مادوں کی باقیات ہوسکتی ہیں۔

Ⅱ. ریورس ٹرانسکرپشن

آر این اے نکالنے کے مکمل ہونے کے بعد، اسے بعد کے تجربات کے لیے سی ڈی این اے میں تبدیل کرنے کی ضرورت ہے، اس لیے الٹ مرحلہ ضروری ہے۔ریورس ٹرانسکرپٹ کو ریورس ٹرانسکرپٹیس اور پرائمر کے انتخاب سے متعارف کرایا جائے گا:

ٹرانسکرپٹیز کا انتخاب ریورس کریں:

عام ریورس ٹرانسکرپٹیز میں AMV RTase اور MMLV RTase شامل ہیں۔AMV RTase کے RNase H میں مضبوط سرگرمی، مختصر ترکیب کی لمبائی، کم ترکیب کی مقدار اور اچھی تھرمل استحکام (42 ~ 55℃) ہے۔MMLV RTase کی RNase H سرگرمی کمزور ہے، ترکیب کی لمبائی لمبی ہے، ترکیب کی مقدار زیادہ ہے، اور تھرمل استحکام ناقص ہے (37 ~ 42℃)۔

چونکہ RNase H انزائم RNA ٹیمپلیٹ کو کم کرنے کا کام کرتا ہے، کمزور RNase H سرگرمی کے ساتھ MMLV کو ریورس ٹرانسکرپشن کے دوران ترجیحی طور پر منتخب کیا جانا چاہئے، اور بعد میں جینیاتی انجینئرنگ کے بعد، MMLV کا تھرمل استحکام ایک کوالٹی لیپ تک پہنچ گیا ہے۔فورجین لیناForeasy ریورس ٹرانسکرپٹیس (M-MLV ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے) ایک مثال کے طور پر، یہ ایک نئی ریورس ٹرانسکرپٹیس ہے جس کا اظہار E. coli انجنیئرڈ بیکٹیریا میں جینیاتی ری کنبینیشن ٹیکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا ہے۔یہ ایک ریکومبیننٹ ڈی این اے پولیمریز ہے جو سنگل پھنسے ہوئے RNA، DNA، یا RNA:DNA ہائبرڈ سے ایک تکمیلی DNA اسٹرینڈ کی ترکیب کرتا ہے۔اس میں کوئی RNase H سرگرمی، مضبوط استحکام، مضبوط RNA وابستگی، اور پتہ لگانے کی اعلی حساسیت نہیں ہے۔

 

Foreasy ریورس ٹرانسکرپٹیس (M-MLV ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے)

پرائمر کا انتخاب:

عام طور پر RT پرائمر تین زمروں میں آتے ہیں: oligo dT، بے ترتیب پرائمر، اور جین کے لیے مخصوص پرائمر۔مختلف تجرباتی ضروریات کے مطابق استعمال کے لیے موزوں پرائمر منتخب کریں۔

1. اگر ٹیمپلیٹ یوکرائیوٹک اصل کا ہے اور دیر سے سی ڈی این اے کو روٹین پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، تو اولیگو (ڈی ٹی) کی سفارش کی جاتی ہے۔اگر بعد کے تجربے کو صرف qPCR کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، تو اولیگو (dT) کو رینڈم پرائمر کے ساتھ ملانے کی سفارش کی جاتی ہے تاکہ ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی کو بہتر بنایا جا سکے۔

2. اگر ٹیمپلیٹ پروکیریٹس سے ہے، تو رینڈم پرائمر یا جین کے مخصوص پرائمر کو ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے منتخب کیا جانا چاہیے۔

Ⅲ.کیو پی سی آر

فلوروسینس کوانٹیفیکیشن بنیادی طور پر مقداری طریقوں کے انتخاب، پرائمر ڈیزائن کے اصولوں، ROX انتخاب، رد عمل کے نظام کی ترتیب اور رد عمل کے حالات کی ترتیب وغیرہ سے وضاحت کی جاتی ہے۔

مقداری طریقوں کا انتخاب:

مقداری طریقوں کو رشتہ دار مقداری طریقوں اور مطلق مقداری طریقوں میں تقسیم کیا گیا ہے۔متعلقہ مقدار کا استعمال جین کے اظہار پر کچھ علاج کے طریقوں کے اثر کا پتہ لگانے، مختلف اوقات میں جین کے اظہار کے فرق کا پتہ لگانے اور مختلف ٹشوز میں جین کے اظہار کے فرق کا موازنہ کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔مطلق مقدار کا تعین وائرس میں نیوکلک ایسڈ کی مقدار کا پتہ لگا سکتا ہے وغیرہ۔تجربات کرتے وقت، ہمیں اپنے تجربات کے مطابق مناسب مقداری طریقوں کا انتخاب کرنا چاہیے۔

پرائمر ڈیزائن کے اصول:

کیو پی سی آر کے لیے پرائمر کے ڈیزائن کا براہ راست تعلق امپلیفیکیشن کی کارکردگی اور مصنوعات کی مخصوصیت سے ہے۔لہذا، اچھے پرائمر کو صحیح طریقے سے ڈیزائن کرنا کامیاب کیو پی سی آر کا پہلا قدم ہے۔پرائمر کے ڈیزائن میں، روایتی پرائمر ڈیزائن کے اصول پر پورا اترتے وقت درج ذیل اصولوں پر توجہ دی جانی چاہیے۔

1. ہدف کے ٹکڑے کی لمبائی 100 اور 300 bp کے درمیان کنٹرول کی جاتی ہے۔

2. جینومک ڈی این اے کے اثر سے بچنے کے لیے کراس ایکسون ڈیزائن؛

3. ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کے لیے ڈیزائن کیے گئے پرائمرز کو جانچنے کی ضرورت ہے، اور صرف اس صورت میں جب ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی معیاری (90-110%) تک پہنچ جائے تو انہیں مقداری تجربات کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

4. پرائمر کی حراستی عام طور پر 0.1uM اور 1.0uM کے درمیان بہتر ہوتی ہے۔

کا انتخابROX:

مقداری رد عمل کے عمل میں، ROX آپٹیکل راستے کے فرق، پائپنگ کی خرابی یا بخارات اور گاڑھا ہونے کی وجہ سے حجم کے فرق کو یکساں طور پر ایڈجسٹ کر سکتا ہے، جس سے نتائج کی تکراری صلاحیت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔تاہم، یہ واضح رہے کہ ROX کا انتخاب آلہ سے متعلق ہے۔اگر qPCR آلے میں سوراخوں کے درمیان فرق کو خود بخود درست کرنے کا کام ہے، تو اسے ROX شامل کرنے کی ضرورت نہیں ہے۔دوسری صورت میں، اسے ROX اصلاح شامل کرنے کی ضرورت ہے۔ری ایجنٹس خریدنے میں چھوٹے شراکت داروں کو صحیح ROX کا انتخاب کرنے کے لیے استعمال ہونے والے آلے کے مطابق ہونا چاہیے، بعد میں ہونے والی غلطیوں سے بچیں۔

رد عمل کے نظام کی تیاری:

20ul اور 50ul کے رد عمل والے حجم کو ترجیح دی جاتی ہے۔جب نظام وضع کیا جائے تو درج ذیل امور پر توجہ دی جانی چاہیے۔

1. رد عمل کے نظام کو الٹرا کلین ورک بینچ، نئے ڈی ڈی ایچ میں وینٹیلیشن کے ذریعے تیار کرنے کی ضرورت ہے۔₂O ہر تجربے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔

2. ہر تجربے کو NTC تیار کرنے کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ اس بات کی تصدیق کی جا سکے کہ آیا سسٹم میں آلودگی موجود ہے، اور پرائمر کے ہر جوڑے کو سسٹم کو تیار کرتے وقت NTC کرنے کی ضرورت ہے۔

3. یہ معلوم کرنے کے لیے کہ آیا آر این اے ٹیمپلیٹ میں جی ڈی این اے کی باقیات موجود ہیں، پتہ لگانے کے لیے ہر نمونے کے لیے NRT تیار کیا جا سکتا ہے۔

4. نظام کی تیاری کرتے وقت، ایک نمونے کے لیے کم از کم 3 تکنیکی تکرار کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

5. جب ٹیمپلیٹ سی ڈی این اے ہو، تو اسے 5-10 بار پتلا کرنے کی سفارش کی جاتی ہے تاکہ qPCR کے تجربے پر ریورس ٹرانسکرپشن سسٹم کی روک تھام کے اثر کو کم کیا جا سکے۔بہتر ہے کہ تمثیل کی مقدار کو میلان کے لحاظ سے دریافت کیا جائے، تاکہ CT کی قیمت 20-30 کے درمیان آئے۔

6. رد عمل کی مطلوبہ تعداد کا تعین کریں، رد عمل کی تعداد کی بنیاد پر 5-10% اضافہ کریں، اور حجم کی ترتیب نمبر کا حساب لگائیں۔

7، نظام کو پریمکس اصول کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا جاتا ہے، سینٹرفیوگریشن کے بعد مکس ہوتا ہے اور اس بات کو یقینی بناتا ہے کہ کوئی بلبلا نہ ہو۔

8، جہاں تک ممکن ہو معاون استعمال کی اشیاء کو منتخب کرنے کے لئے.

متعلقہ RT-qPCR کٹ