ہر کوئی qRT-PCR تجربے کے اصول، پرائمر ڈیزائن، نتیجہ کی تشریح وغیرہ کے بارے میں بات کر رہا ہے، لیکن مجھے لگتا ہے کہ مجھے آپ کے ساتھ qRT-PCR کے تجرباتی آپریشن کا اشتراک کرنا چاہیے۔یہ چھوٹا ہے، لیکن یہ نتائج کے بارے میں ہے.

qRT-PCR کرنے سے پہلے، ہمیں اپنے RNA اور آپریشن کے طریقوں کے بارے میں واضح سمجھنا ضروری ہے۔بہر حال، ہماری کوششوں کا مقصد محض مشق کرنے کے بجائے نتائج حاصل کرنا ہے۔لہذا qRT-PCR کرنے سے پہلے، ہمیں درج ذیل مسائل کا تعین کرنے کی ضرورت ہے (جن میں سے کچھ صرف SYBR پر لاگو ہوتے ہیں)۔

1 کیا آپ کو یقین ہے کہ آپ کا آر این اے کم نہیں ہوا ہے؟

NanoDrop 2000 صرف RNA کے ارتکاز اور پاکیزگی کا پتہ لگا سکتا ہے، لیکن RNA کی سالمیت کا پتہ نہیں لگا سکتا۔

RNA (RNA Intesity Number) قدر RNA کی سالمیت کی عکاسی کر سکتی ہے، جس کا پتہ Agilent 2100 Bioanalyzer سسٹم کے ذریعے کیا جاتا ہے۔

مختلف آر این اے نمونوں (یوکرائٹس) کے لیے RIN قدروں کا اسکیمیٹک خاکہ

تاہم، لیبارٹریوں میں عام طور پر Agilent 2100 Bioanalyzer نہیں ہوتا ہے۔اس صورت میں، ہم formaldehyde جیل کے ذریعے پتہ لگا سکتے ہیں، لیکن RNA کی کل مقدار کی ضرورت زیادہ ہے، اس لیے تیز ترین طریقہ یہ ہے کہ عام جیل الیکٹروفورسس کا استعمال کیا جائے۔اس کا نیوکلیز سے پاک ماحول میں ہونا ضروری ہے، اس لیے الیکٹروفورسس ٹینک، سول بوتل، جیل بریکٹ اور کنگھی کو DEPC پانی سے دھونا ضروری ہے۔ایگروز نیوکلیز سے پاک بھی ہے (جب تک کہ اسے تازہ کھولا جاتا ہے)، اور لوڈنگ بفر کو 1.2% جیل کے ساتھ جتنا ممکن ہو تازہ کھولا جانا چاہیے۔

نوٹ کریں کہ جیل کو مکمل طور پر تحلیل کیا جانا چاہیے، ورنہ یہ غیر ہم جنس بینڈز کا سبب بنے گا، جیسا کہ تصویر میں نمونہ 9 میں دکھایا گیا ہے۔اگر وولٹیج بہت زیادہ ہے یا زیادہ دیر تک چل رہا ہے تو گرمی پیدا کرے گا اور آر این اے کی تنزلی کا سبب بنے گا، اس لیے وولٹیج اور وقت کو مناسب طریقے سے کنٹرول کیا جانا چاہیے۔اس کے علاوہ، جیل چلانے سے یہ بھی تعین کیا جا سکتا ہے کہ آیا نمونے میں ڈی این اے کی باقیات موجود ہیں، اور یہ مشاہدہ کر سکتے ہیں کہ آیا ڈسپنسنگ کنویں میں بڑی تعداد میں برقرار رکھے ہوئے بینڈ موجود ہیں۔

اعداد و شمار.آر این اے کی جیل الیکٹروفورسس کا پتہ لگانا

2 کیا آپ کو اپنے cDNA کے ارتکاز کے بارے میں یقین ہے؟

لیبارٹری میں بڑے بھائیوں کا تجربہ یہ ہے کہ 20 ul نظام کے سی ڈی این اے کو ہر ایک الٹ کے ذریعے براہ راست 20X پتلا کیا جاتا ہے، جبکہ پوسٹ ڈاکٹرل بہنوں کو 10X پتلا کیا جاتا ہے۔میں عام طور پر صورتحال پر منحصر ہوں۔کیونکہ ہر شخص کے ذریعہ بیان کردہ آر این اے کا معیار مختلف ہے، ریورسل کی سطح بھی مختلف ہے، اور الٹنے والی ٹیکنالوجی مستحکم نہیں ہوسکتی ہے۔

لہذا جب بھی مجھے الٹا سی ڈی این اے ملے گا، میں پہلے اسے تقریباً 3 بار پتلا کروں گا، اور پھر RT-PCR کرنے کے لیے ہاؤس کیپنگ جین کا استعمال کروں گا، مخصوص ارتکاز کی نشاندہی کرنے کے لیے، سائیکلوں کی تعداد عام طور پر 25 سائیکل ہوتی ہے، اور پھر حتمی کم کرنے کے عنصر کا تعین کروں گا۔

3 کیا آپ کو یقین ہے کہ آپ کے پرائمر استعمال میں آسان ہیں؟

یہ qRT-PCR کے پگھلنے والے منحنی خطوط سے گزر سکتا ہے، لیکن اس کے لیے پھر بھی رقم خرچ ہوتی ہے۔بہت زیادہ رقم کے بغیر لیبارٹریوں کے لیے، جب انہیں بہت سارے پرائمر ملتے ہیں، تو وہ عام RT-PCR کا استعمال کر کے یہ دیکھ سکتے ہیں کہ آیا یہ سنگل بینڈ ہے اور پرائمر کی مخصوصیت کی شناخت کر سکتے ہیں۔اگر لیبارٹری میں پیسے کی کمی نہیں ہے، تو پگھلنے والے منحنی خطوط کے ذریعے تمام پرائمر کی خصوصیت کو ایک بار پہچانا جا سکتا ہے۔

4 کیا آپ کو یقین ہے کہ آپ کے تجرباتی حالات موزوں ہیں؟

SYBR کو تیز روشنی سے محفوظ کیا جانا چاہیے، اس لیے SYBR ریجنٹ شامل کرتے وقت اوور ہیڈ لائٹ کو بند کرنے کی کوشش کریں، اور اسے مکمل کرنے کے لیے صرف مدھم روشنی کا استعمال کرنے کی ضرورت ہے۔

SYBR کو 4°C پر اسٹور کریں۔جب استعمال میں ہو، جھاگ سے بچنے کے لیے اچھی طرح سے مکس کرنے کے لیے آہستہ سے اوپر اور نیچے الٹیں، اور زور سے بھنور نہ لگائیں۔

کچھ چھوٹی بہنیں پی سی آر بورڈ پر نمونے ملانے کے خوف سے نمبر بنانا پسند کرتی ہیں، جو کہ غلط ہے۔چونکہ آپ کے مارکر فلوروسینٹ سگنلز کے مجموعہ کو متاثر کرنے کا بہت زیادہ امکان رکھتے ہیں، میں عام طور پر جونیئرز کو تجویز کرتا ہوں کہ وہ میموری میں مدد کے لیے تجرباتی نوٹ بک استعمال کریں، جیسا کہ ذیل میں دکھایا گیا ہے۔

اعداد و شمار.qRT-PCR نمونہ لوڈنگ ڈایاگرام

5 کیا آپ کو یقین ہے کہ آپ یہ ٹھیک کر رہے ہیں؟

دستانے پہننا یقینی بنائیں، دستانے پہنیں، دستانے پہنیں، اور اہم باتیں تین بار کہیں۔

SYBR کی روشنی کو کم کرنے کے لیے، میں ذاتی طور پر سب سے پہلے ایک ٹیمپلیٹ شامل کرنا چاہتا ہوں، جیسا کہ ذیل کی تصویر میں دکھایا گیا ہے۔تجربے کے مطابق، ٹیمپلیٹ کی تھوڑی مقدار کے اضافے سے نمونے لینے کی غلطیوں کا امکان ہے۔لہذا، تھوڑی مقدار میں ٹیمپلیٹ شامل کرنے کی وجہ سے پیدا ہونے والی خرابی کو کم کرنے کے لیے، میں عام طور پر دوبارہ نمونے کو دوگنا کرتا ہوں، اور H2O2 کی مقدار کو کم کرنے کے لیے نمونہ شامل کرتے وقت رقم کو دگنا کرتا ہوں۔

اعداد و شمار.qRT-PCR لوڈنگ کا اسکیمیٹک خاکہ

پھر qRT-PCR سسٹم کو مندرجہ ذیل ترتیب دیں۔

اعداد و شمار.qRT-PCR سسٹم کی تیاری کا خاکہ

نوٹ: ترتیب کے عمل کو برف پر کرنے کی ضرورت ہے۔

نمونہ شامل کرنے کے بعد، شفاف سگ ماہی فلم چسپاں کریں.اپنے ہاتھوں سے شفاف سگ ماہی فلم کی سطح کو نہ چھونے کی کوشش کریں، صرف فلم کے دونوں اطراف کی جگہ سے کام کریں۔کیونکہ انگلیوں کے نشانات فلورسنٹ سگنلز کے مجموعہ کو بھی متاثر کر سکتے ہیں۔اس کے بعد 10 سیکنڈ تک کم رفتار سے فوری طور پر سینٹری فیوج کرنے کے لیے سینٹری فیوج کا استعمال کریں تاکہ نمونے کو دیوار پر لٹکنے سے روکا جا سکے۔

متعلقہ مصنوعات:

سیل ڈائریکٹ RT-qPCR کٹ

RT ایزی II