RNase ایک حساس لفظ ہے جسے اکثر طلباء جو RNA نکالنے کے تجربات کرتے ہیں وہ سننا نہیں چاہتے۔مکمل طور پر مسلح، آر این اے جو آخر کار انتہائی زہریلے ریجنٹس فینول اور کلوروفارم کے ساتھ نکالا گیا تھا، انحطاط پذیر تھا۔میں صلح نہیں کر رہا ہوں!!!آج، آئیے مشہور Rnase کی اصل پر ایک نظر ڈالتے ہیں۔

Ribonuclease (RNase)، یا RNase، ایک نیوکلیز ہے جو RNA کو چھوٹے انووں میں ہائیڈولائز کر سکتا ہے۔RNase، ایک چھوٹے مالیکیول پروٹین کے طور پر، غیر معمولی طور پر مستحکم ہے۔ .روایتی اعلی درجہ حرارت اور ہائی پریشر بھاپ کی نس بندی اور پروٹین روکنے والے اسے مکمل طور پر غیر فعال نہیں کرسکتے ہیں۔RNase کا استحکام بنیادی طور پر ڈھانچے میں موجود ڈسلفائیڈ بانڈز سے آتا ہے۔مثال کے طور پر، بوائین لبلبہ کے عام طور پر استعمال ہونے والے RNase میں صرف 124 امینو ایسڈ ہوتے ہیں، لیکن اس میں 4 ڈسلفائیڈ بانڈ ہوتے ہیں۔سلفر بانڈ اور ڈسلفائیڈ بانڈ RNase کو بہترین تھرمل استحکام کے ساتھ دیتے ہیں۔اس کے علاوہ، rnase کا نسبتاً چھوٹا مالیکیولر وزن ہے اور بہت سے معاملات میں اس کی اصل شکل کو تیزی سے بحال کر سکتا ہے۔

انتہائی مستحکم ہونے کے علاوہ،RNases لیبارٹری میں ہر جگہ موجود ہیں۔ .RNase ایک حیاتیاتی دفاعی طریقہ کار ہے۔سیل کے لیے، خارجی RNA اکثر مہلک ہوتا ہے۔exogenous DNA کے مقابلے میں، exogenous RNA اکثر زیادہ خطرناک ہوتا ہے۔آر این اے کو خوشی سے نقل اور ترجمہ کیا جاتا ہے، اس لیے تقریباً تمام جانداروں نے خارجی RNA کے حملے کے خلاف دفاع کے لیے RNases کو تیار کیا ہے۔لہذا، لیبارٹری میں کاشت کیے گئے بیکٹیریل خلیے اور آپ جو RNA نکالتے ہیں RNase کی مہک خارج کرتے ہیں۔انسانی جسم کے رطوبتوں (لعاب، آنسو، وغیرہ) میں RNase کی ایک بڑی مقدار ہوتی ہے، لہذا جب RNA کم ہو جائے تو مت روئیں۔آپ جتنا زیادہ روئیں گے، آر این اے کی تنزلی اتنی ہی خراب ہوگی!!سسٹر ڈائیو آر این اے نکالنے کے لیے موزوں نہیں ہے!

اس کے علاوہ، آپ کی نازک جلد میں بھی RNase کی بہت زیادہ مقدار ہوتی ہے، اور مارکر، پائپیٹ، ریفریجریٹر کے دروازے، اور دروازے کے ہینڈل جن کو جلد نے چھوا ہوتا ہے وہ بھی RNase پر مشتمل ہوتا ہے۔

بہت زیادہ گھومنے پھرنے کے ساتھ، آئیے ایک نظر ڈالتے ہیں کہ RNases سے کیسے نمٹا جائے۔

آر این اے کو ہٹاتے وقت سب سے پہلی چیز جس کے بارے میں ہر کوئی سوچتا ہے۔ڈی ای پی سی(ڈائیتھائل پائرو کاربونیٹ)۔DEPC بنیادی طور پر RNase ایکٹو گروپ ہسٹائڈائن کے imidazole رنگ کے ساتھ ملا کر پروٹین کو ڈینیچر کرتا ہے، اس طرح انزائم کی سرگرمی کو روکتا ہے۔0.1% DEPC Rnase پر بہتر طریقے سے ہٹانے کا اثر ڈال سکتا ہے، لیکن ہمیں اس بات پر توجہ دینے کی ضرورت ہے کہ DEPC ایک معروف کارسنجن ہے، اس لیے اسے استعمال کرتے وقت خصوصی توجہ دی جانی چاہیے۔

RNase کے لیے، ہمیں دو پہلوؤں سے شروع کرنے کی ضرورت ہے،سب سے پہلے endogenous RNase کی سرگرمی کو روکنا ہے۔

روایتی RNA نکالنے والے ری ایجنٹس جیسے کہ ٹرائزول میں موجود guanidine isothiocyanate اور DTT RNase کے ڈسلفائیڈ بانڈ کو کھول سکتے ہیں، لیکن ابھی بھی کچھ RNases ہیں، خاص طور پر ٹشو کے نمونوں میں، اس لیے کم درجہ حرارت پر توجہ دیں۔

1۔ٹشو کے نمونے کو نکالنے کے بعد فوری طور پر مائع نائٹروجن میں، یا تجارتی RNA تحفظ کے محلول میں ڈبو دیں۔

2.سیل کے نمونے کے آر این اے کو نکالنے کے بعد، اسے لیسز کے محلول میں شامل کریں اور اسے آئس باکس پر لیز کریں۔

3. پیسنے کے لیے مائع نائٹروجن کا استعمال کرنا بہتر ہے۔ جب ٹشو کے نمونے ہم آہنگ ہوتے ہیں۔مائع نائٹروجن کے بغیر الیکٹرک ہوموجنائزر استعمال کرتے وقت ہوموجنیٹ اڈاپٹر کو مکمل طور پر پہلے سے ٹھنڈا کرنے پر توجہ دیں۔

دوسرا exogenous DNase ہے۔

1۔مکمل طور پر مسلح رہیں، لیب کوٹ پہنیں، ماسک پہنیں، اور نئے دستانے پہننا یقینی بنائیں (اتنی کفایت شعاری نہ کریں! واضح رہے کہ Trizol انتہائی سنکنار ہے، اور یہ دستانے کے ذریعے بھی بہت مضبوط ہے، اس لیے اپنے ہاتھوں پر نہ ٹپکیں)۔

2.تمام استعمال شدہ پائپیٹ ٹپس، EP ٹیوبز، پی سی آر ٹیوبیں اور دیگر آلات کا ڈی-آر نیس علاج کیا جانا چاہیے۔اسے 0.1% DEPC میں بھگویا جا سکتا ہے اور پھر زیادہ دباؤ میں دبایا جا سکتا ہے۔فوم ہڈ میں آپریشن پر توجہ دیں۔مقامی ظالم انزائمز کو ہٹانے کے لیے براہ راست استعمال کی اشیاء خرید سکتے ہیں۔

PS: میں آپ کو ایک سست طریقہ بتاتا ہوں۔اگرچہ اعلی درجہ حرارت اور ہائی پریشر RNase کو مکمل طور پر نہیں ہٹا سکتا، لیکن یہ اس کے ایک بڑے حصے کو ہٹا دے گا۔2 بار اعلی درجہ حرارت اور ہائی پریشر کا اچھا اثر پڑتا ہے، اور RNA نکالنے کا بہت کم اثر ہوتا ہے۔

3.الکحل پروٹین کو ختم کر سکتا ہے،لہذا RNA نکالنے کی میز کو 75٪ الکحل سے صاف کیا جاسکتا ہے۔ ، اور دستانے بھی الکحل کے ساتھ چھڑک سکتے ہیں۔

4.حتمی RNA تحلیل کرنے والے محلول اور سینٹری فیوج ٹیوب کا بھی ڈی-RNase علاج کیا جانا چاہیے۔DEPC پانی عام طور پر استعمال ہونے والا RNA تحلیل کرنے والا محلول ہے۔آئیے DEPC پانی کی تیاری کے صحیح طریقے کے بارے میں بات کرتے ہیں (جب آپ اسے خریدتے ہیں تو تجارتی DEPC کو دوبارہ پیک کرنا یاد رکھیں)

DEPC کو 1:1000 پر الٹرا پیور پانی میں شامل کریں، اچھی طرح سے ہلائیں، رات بھر 37 ° C پر کھڑے رہنے دیں، اور 121 ° C پر اعلی درجہ حرارت اور ہائی پریشر میں 15 منٹ تک جراثیم سے پاک کریں۔DEPC پانی کو 1ml aliquots میں -20°C پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔

آخر میں، خلاصہ: کم درجہ حرارت کلید ہے، استعمال کی اشیاء کو اچھی طرح سے سنبھالا جاتا ہے، مکمل طور پر مسلح اور کم بات!

ٹھیک ہے، یہ آج کی حکمت عملی کے لئے ہے.میں آپ کو آر این اے کی تمام ارتکاز اور پاکیزگی کی خواہش کرتا ہوں جس کا آپ نے ذکر کیا ہے۔A260/A280 دونوں 2.0 ہیں!!!

یقینا، اگر آپ استعمال کرتے ہیں aکمرے کے درجہ حرارت آپریشن آر این اے نکالنے کٹ، آپ کو مندرجہ بالا پریشانیوں کا سامنا نہیں ہوسکتا ہے۔

کمرے کے درجہ حرارت پر آپریشن، DNase کو شامل کیے بغیر، 11 منٹ میں خلیوں سے کل RNA نکالتا ہے، اور 30 ​​منٹ میں جانوروں کے بافتوں یا پودوں سے کل RNA نکالتا ہے۔

آزمائشی نمونوں کے لیے، براہ کرم رابطہ کریں:overseas@foregene.com

متعلقہ مصنوعات:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/