پرائمر ڈیزائن کی بنیاد (99٪ مسائل حل کیے جا سکتے ہیں)
1. پرائمر کی لمبائی: نصابی کتاب کے لیے 15-30bp کی ضرورت ہوتی ہے، عام طور پر تقریباً 20bp۔خاصیت کو یقینی بنانے کے لیے اصل حالت 18-24bp ہونا بہتر ہے، لیکن جتنا لمبا بہتر ہوگا، بہت لمبا پرائمر بھی مخصوصیت کو کم کرے گا، اور پیداوار کو کم کرے گا۔
2. پرائمر ایمپلیفیکیشن اسپین: 200-500bp مناسب ہے، اور ٹکڑے کو مخصوص حالات میں 10kb تک بڑھایا جا سکتا ہے۔
3. پرائمر بیس: G+C کا مواد 40-60% ہونا چاہیے، بہت کم G+C ایمپلیفیکیشن اثر اچھا نہیں ہے، بہت زیادہ G+C غیر مخصوص بینڈ ظاہر کرنا آسان ہے۔ATGC 5 سے زیادہ پیورین یا پیریمائڈائن نیوکلیوٹائڈس کے جھرمٹ سے گریز کرتے ہوئے تصادفی طور پر بہترین تقسیم کیا جاتا ہے۔استحکام کو بڑھانے کے لیے 5′ اینڈ اور انٹرمیڈیٹ سیکونسز کے لیے ملٹی جی سی، 3′ اینڈ پر بھرپور GC سے بچیں، آخری 3 بیسز کے لیے کوئی GC نہیں، یا آخری 5 میں سے 3 بیسز کے لیے کوئی GC نہیں۔
4. پرائمر میں ثانوی ساخت سے بچیں، اور دو پرائمر کے درمیان تکمیل سے بچیں، خاص طور پر 3 کے آخر میں تکمیل، بصورت دیگر پرائمر ڈائمر بن جائے گا اور غیر مخصوص ایمپلیفائیڈ بینڈز بنائے جائیں گے۔
5. پرائمر کے 3 'سرے پر اڈوں کو، خاص طور پر آخری اور آخری اڈوں کو، جوڑا نہ بنائے جانے والے ٹرمینل اڈوں کی وجہ سے PCR کی ناکامی سے بچنے کے لیے سختی سے جوڑا جانا چاہیے۔
6. پرائمر کو مناسب کلیویج سائٹس کے ساتھ شامل کیا جا سکتا ہے، اور ایمپلیفائیڈ ٹارگٹ سیکوئنس میں ترجیحی طور پر مناسب کلیویج سائٹس ہونی چاہئیں، جو کلیویج کے تجزیہ یا مالیکیولر کلوننگ کے لیے بہت فائدہ مند ہے۔
7. پرائمر کی مخصوصیت: پرائمر میں نیوکلک ایسڈ سیکوینس ڈیٹا بیس میں دیگر ترتیبوں کے ساتھ کوئی واضح ہم آہنگی نہیں ہونی چاہیے۔
8. سافٹ ویئر استعمال کرنا سیکھیں: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (یہ آن لائن ڈیزائن بہترین کام کرتا ہے)۔
مندرجہ بالا مواد کم از کم 99% پرائمر ڈیزائن کے مسائل حل کر سکتا ہے۔
پرائمر ڈیزائن کی تفصیلات کو کنٹرول کریں۔
1. پرائمر کی لمبائی
عام پرائمر کی لمبائی 18 ~ 30 بیسز ہے۔عام طور پر، پرائمر کے اینیلنگ درجہ حرارت کا تعین کرنے والا سب سے اہم عنصر پرائمر کی لمبائی ہے۔پرائمر کا اینیلنگ درجہ حرارت عام طور پر منتخب کیا جاتا ہے (Tm قدر -5℃)، اور کچھ براہ راست Tm قدر استعمال کرتے ہیں۔پرائمر کے اینیلنگ درجہ حرارت کا اندازہ لگانے کے لیے درج ذیل فارمولوں کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔
جب پرائمر کی لمبائی 20bp سے کم ہو: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
جب پرائمر کی لمبائی 20bp سے زیادہ ہو: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/لمبائی-5℃
اس کے علاوہ، اینیلنگ درجہ حرارت کا حساب لگانے کے لیے بہت سے سافٹ ویئر بھی استعمال کیے جاسکتے ہیں، حساب کتاب کا اصول مختلف ہوگا، اس لیے بعض اوقات کیلکولیشن شدہ ویلیو میں ایک چھوٹا سا فرق ہوسکتا ہے۔PCR کے رد عمل کو بہتر بنانے کے لیے، مختصر ترین پرائمر جو 54℃ سے کم نہ ہونے والے اینیلنگ درجہ حرارت کو یقینی بناتے ہیں، بہترین کارکردگی اور مخصوصیت کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں۔
مجموعی طور پر، پرائمر کی مخصوصیت ہر اضافی نیوکلیوٹائڈ کے لیے چار کے فیکٹر سے بڑھ جاتی ہے، تاکہ زیادہ تر ایپلی کیشنز کے لیے پرائمر کی کم از کم لمبائی 18 نیوکلیوٹائڈز ہو۔پرائمر کی لمبائی کی اوپری حد بہت اہم نہیں ہے، بنیادی طور پر رد عمل کی کارکردگی سے متعلق ہے۔اینٹروپی کی وجہ سے، پرائمر جتنا لمبا ہوتا ہے، ڈی این اے پولیمریز کو باندھنے کے لیے ایک مستحکم ڈبل سٹرینڈ ٹیمپلیٹ بنانے کے لیے ہدف کے ڈی این اے سے منسلک ہونے کی شرح اتنی ہی کم ہوتی ہے۔
پرائمر ڈیزائن کرنے کے لیے سافٹ ویئر کا استعمال کرتے وقت، پرائمر کی لمبائی کا تعین TM قدر کے ذریعے کیا جا سکتا ہے، خاص طور پر فلوروسینس مقداری PCR کے پرائمرز کے لیے، TM=60℃ یا اس کو کنٹرول کیا جانا چاہیے۔
2.GC مواد
عام طور پر، پرائمر کی ترتیب میں G+C کا مواد 40%~60% ہوتا ہے، اور GC مواد اور پرائمر کے جوڑے کی Tm ویلیو کو مربوط کیا جانا چاہیے۔اگر پرائمر میں سنگین GC یا AT کا رجحان ہے، تو A, T یا G اور C ٹیل کی مناسب مقدار پرائمر کے 5' سرے میں شامل کی جا سکتی ہے۔
3. اینیلنگ درجہ حرارت
اینیلنگ کا درجہ حرارت غیر چین درجہ حرارت سے 5 ℃ کم ہونا چاہئے۔اگر پرائمر اڈوں کی تعداد کم ہے تو، اینیلنگ درجہ حرارت کو مناسب طریقے سے بڑھایا جا سکتا ہے، جو پی سی آر کی مخصوصیت کو بڑھا سکتا ہے۔اگر اڈوں کی تعداد زیادہ ہے تو، اینیلنگ درجہ حرارت کو مناسب طریقے سے کم کیا جا سکتا ہے.4 ℃ ~ 6 ℃ کے پرائمر کے جوڑے کے درمیان اینیلنگ درجہ حرارت کا فرق پی سی آر کی پیداوار کو متاثر نہیں کرے گا، لیکن مثالی طور پر پرائمر کے جوڑے کا اینیلنگ درجہ حرارت ایک جیسا ہے، جو 55 ℃ ~ 75 ℃ کے درمیان مختلف ہو سکتا ہے۔
4. امپلیفیکیشن ٹیمپلیٹ کے ثانوی ڈھانچے کے علاقے سے بچیں۔
ایمپلیفائیڈ فریگمنٹ کا انتخاب کرتے وقت ٹیمپلیٹ کے ثانوی ڈھانچے کے علاقے سے گریز کرنا بہتر ہے۔ہدف کے ٹکڑے کے مستحکم ثانوی ڈھانچے کی پیش گوئی اور اندازہ متعلقہ کمپیوٹر سافٹ ویئر سے لگایا جا سکتا ہے، جو ٹیمپلیٹ کے انتخاب کے لیے مددگار ہے۔تجرباتی نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ توسیع اکثر اس وقت ناکام ہوتی ہے جب توسیع کی جانے والی خطہ کی آزاد توانائی (△G) 58.6lkJ/mol سے کم ہو۔
5. ہدف کے ڈی این اے سے مماثلت نہیں ہے۔
جب ایمپلیفائیڈ ٹارگٹ ڈی این اے کی ترتیب بڑی ہوتی ہے، تو ایک پرائمر ٹارگٹ ڈی این اے کے متعدد حصوں سے منسلک ہو سکتا ہے، جس کے نتیجے میں متعدد بینڈز نمودار ہوتے ہیں۔اس بار BLAST سافٹ ویئر ٹیسٹنگ کا استعمال ضروری ہے، ویب سائٹ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.سیدھ دو ترتیب (bl2seq) کو منتخب کریں۔
زون 1 میں پرائمر سیکوینسز کو چسپاں کرنا اور ڈی این اے سیکوینسز کو زون 2 میں ٹارگٹ کرنا قابل تبادلہ ہے، اور BLAST تکمیلی، اینٹی سینس، اور دیگر امکانات کا حساب لگاتا ہے، اس لیے صارفین کو یہ دیکھنے کی ضرورت نہیں ہے کہ آیا دونوں زنجیریں سینس چینز ہیں۔اگر آپ ڈیٹا بیس میں ترتیب کا GI نمبر جانتے ہیں تو آپ GI نمبر بھی درج کر سکتے ہیں، لہذا آپ کو ترتیب کے بڑے حصے کو پیسٹ کرنے کی ضرورت نہیں ہے۔آخر میں، 3 پر سیدھ پر کلک کریں یہ دیکھنے کے لیے کہ آیا پرائمر کے ہدف DNA میں متعدد ہم جنس سائٹس ہیں۔
6. پرائمر ٹرمینل
پرائمر کا 3 'اختتام وہ جگہ ہے جہاں سے توسیع شروع ہوتی ہے، اس لیے ضروری ہے کہ مماثلت کو وہاں سے شروع ہونے سے روکا جائے۔3 کا اختتام لگاتار 3 G یا C سے زیادہ نہیں ہونا چاہئے، کیونکہ اس کی وجہ سے G+C افزودگی ترتیب والے علاقے میں پرائمر غلطی سے ٹرگر ہو جائے گا۔3' اینڈ کوئی ثانوی ڈھانچہ نہیں بنا سکتا، سوائے خصوصی PCR (AS-PCR) کے رد عمل کے، پرائمر کا 3′ اختتام مماثل نہیں ہو سکتا۔مثال کے طور پر، اگر انکوڈنگ ریجن کو ایمپلیفائی کیا جاتا ہے، تو کوڈن کی تیسری پوزیشن پر پرائمر کے 3 'سرے کو ختم نہیں کیا جانا چاہیے، کیونکہ کوڈن کی تیسری پوزیشن انحطاط کا شکار ہے، جو ایمپلیفیکیشن کی خصوصیت اور کارکردگی کو متاثر کرے گی۔انیکسیشن پرائمر استعمال کرتے وقت، کوڈن یوز ٹیبل کا حوالہ دیں، حیاتیاتی ترجیحات پر توجہ دیں، 3′ سرے پر ملحقہ پرائمر استعمال نہ کریں، اور پرائمر کی زیادہ ارتکاز (1uM-3uM) استعمال کریں۔
7. پرائمر کا ثانوی ڈھانچہ
پرائمر میں خود تکمیلی سلسلے نہیں ہونے چاہئیں، ورنہ پرائمر خود ہی ہیئرپین کے ڈھانچے میں سمٹ جائیں گے، اور یہ ثانوی ڈھانچہ سٹیرک رکاوٹ کی وجہ سے پرائمر اور ٹیمپلیٹس کی بائنڈنگ کو متاثر کرے گا۔اگر مصنوعی فیصلہ استعمال کیا جاتا ہے، تو خود پرائمر کی مسلسل تکمیلی بنیادیں 3bp سے زیادہ نہیں ہونی چاہئیں۔دونوں پرائمر کے درمیان کوئی تکمیلی نہیں ہونا چاہیے، خاص طور پر پرائمر ڈائمرز کی تشکیل کو روکنے کے لیے 3' اینڈ کے تکمیلی اوورلیپ سے گریز کیا جانا چاہیے۔عام طور پر، پرائمر کے ایک جوڑے کے درمیان لگاتار 4 سے زیادہ بیس ہومولوجی یا تکمیلی نہیں ہونا چاہیے۔
8. مارکر یا لوکی شامل کریں۔
ایمپلیفیکیشن کی مخصوصیت پر 5' اینڈ کا بہت کم اثر ہوتا ہے اور اس لیے ایمپلیفیکیشن کی خصوصیت کو متاثر کیے بغیر اس میں ترمیم کی جا سکتی ہے۔پرائمر 5 کے آخر میں ترمیم شامل ہے: انزائم پابندی سائٹ کو شامل کرنا۔لیبل شدہ بایوٹین، فلوروسینس، ڈیگوکسین، Eu3+، وغیرہ۔ پروٹین بائنڈنگ ڈی این اے کی ترتیب کو متعارف کروائیں۔اتپریورتن سائٹس کو متعارف کرانا، اتپریورتن کے سلسلے کو داخل کرنا اور غائب کرنا اور پروموٹر کے سلسلے کو متعارف کرانا، وغیرہ۔ اضافی اڈے ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کو کم و بیش متاثر کریں گے اور پرائمر ڈائمر کی تشکیل کے امکانات میں اضافہ کریں گے، لیکن اگلے مرحلے کے لیے کچھ رعایتیں دی جانی چاہئیں۔اضافی ترتیب جو ہدف کی ترتیب پر موجود نہیں ہیں، جیسے کہ پابندی کی جگہیں اور پروموٹر کی ترتیب، کو خصوصیت کو متاثر کیے بغیر پرائمر کے 5′ سرے میں شامل کیا جا سکتا ہے۔یہ ترتیبیں پرائمر Tm اقدار کے حساب کتاب میں شامل نہیں ہیں، لیکن تکمیلی اور اندرونی ثانوی ساخت کے لیے جانچ کی جانی چاہیے۔
9. ذیلی کلون
زیادہ تر وقت، PCR صرف ابتدائی کلوننگ ہوتا ہے، اور پھر ہمیں ہدف کے ٹکڑے کو مختلف ویکٹرز میں ذیلی کلون کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، لہذا ہمیں PCR مرحلے میں اگلے آپریشن کے لیے اضافی اڈے ڈیزائن کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔
ذیلی کلوننگ کے لیے ڈیزائن کیے گئے کچھ سلسلے کا خلاصہ ذیل میں دیا گیا ہے۔
پابندی endonuclease پابندی سائٹ کو شامل کیا گیا تھا۔
پی سی آر پروڈکٹس کو سب کلون کرنے کے لیے انزائم پابندی والی جگہوں کو شامل کرنا سب سے زیادہ استعمال شدہ طریقہ ہے۔عام طور پر، درار سائٹ 2 ~ 3 حفاظتی اڈوں کو شامل کرنے کی ضرورت ہے درار سائٹ کے 5 'اختتام کے علاوہ میں، چھ اڈوں ہے.تاہم، مختلف خامروں کو درکار حفاظتی اڈوں کی تعداد مختلف ہے۔مثال کے طور پر، SalⅠ کو حفاظتی بنیاد کی ضرورت نہیں ہے، EcoRⅤ کو 1 حفاظتی بنیاد کی ضرورت ہے، NotⅠ کو 2 حفاظتی اڈوں کی ضرورت ہے، اور HindⅢ کو 3 حفاظتی اڈوں کی ضرورت ہے۔
LIC دم جوڑتا ہے۔
LIC کا پورا نام Ligation-Independent cloning ہے، کلوننگ کا ایک طریقہ جسے Navogen نے خاص طور پر PET ویکٹر کے حصے کے لیے ایجاد کیا ہے۔LIC طریقہ سے تیار کردہ پی ای ٹی کیریئر میں غیر تکمیلی 12-15 بیس سنگل اسٹرینڈ کے چپکنے والے سرے ہوتے ہیں، جو ٹارگٹ انسرٹ فریگمنٹ پر متعلقہ چپکنے والے سروں کی تکمیل کرتے ہیں۔ایمپلیفیکیشن کے مقاصد کے لیے، داخل کیے گئے ٹکڑے کی پرائمر 5′ ترتیب کو LIC ویکٹر کی تکمیل کرنی چاہیے۔T4 DNA پولیمریز کی 3′→5′ ایکسٹریکٹ سرگرمی تھوڑے وقت کے بعد داخل کیے گئے ٹکڑے پر ایک سٹرینڈ چپچپا سرہ بنا سکتی ہے۔چونکہ مصنوع صرف تیار شدہ داخل کے ٹکڑے اور ویکٹر کی باہمی اینیلنگ سے تشکیل پا سکتا ہے، یہ طریقہ بہت تیز اور کارآمد ہے، اور اسے کلوننگ کی ہدایت کی جاتی ہے۔
ڈائریکٹڈ ٹی اے کلون ایڈ ٹیل
ٹی اے کلوننگ اس ٹکڑے کو ویکٹر میں نشانہ بنانے سے قاصر تھی، اس لیے بعد میں انویٹروجن نے ایک ایسا ویکٹر متعارف کرایا جو کلوننگ کو نشانہ بنا سکتا تھا، جس کے ایک سرے پر چار نمایاں بیس GTGGS تھے۔لہذا، پی سی آر پرائمر کے ڈیزائن میں، تکمیلی ترتیب کو اسی کے مطابق شامل کیا جانا چاہیے، تاکہ ٹکڑوں کو "اورینٹڈ" بنایا جا سکے۔
اگر آپ کے پاس وقت کم ہے تو، آپ جین کو ویکٹر کے ساتھ ملا کر براہ راست ترکیب آزما سکتے ہیں، جسے ہم میوزیکولرسٹ میں ET جین کی ترکیب کہتے ہیں۔
D. ان فیوژن کلوننگ کا طریقہ
کوئی ligase کی ضرورت نہیں ہے، کوئی طویل ردعمل کی ضرورت نہیں ہے.جب تک پرائمر کے ڈیزائن میں لائنرائزڈ ویکٹر کے دونوں سروں پر ایک تسلسل متعارف کرایا جاتا ہے، تب تک پی سی آر پروڈکٹ اور لائنرائزڈ ویکٹر کو بی ایس اے پر مشتمل ان فیوژن انزائم سلوشن میں شامل کیا جاتا ہے اور آدھے گھنٹے کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر رکھا جاتا ہے، تبدیلی کو انجام دیا جاسکتا ہے۔یہ طریقہ خاص طور پر بڑے حجم کی تبدیلی کے لیے موزوں ہے۔
10. پرائمر کو ضم کریں۔
بعض اوقات، پرائمر ڈیزائن کے بارے میں صرف محدود ترتیب کی معلومات معلوم ہوتی ہیں۔مثال کے طور پر، اگر صرف امینو ایسڈ کی ترتیب معلوم ہو، تو ضم ہونے والے پرائمر کو ڈیزائن کیا جا سکتا ہے۔انضمام پرائمر مختلف ترتیبوں کا ایک مرکب ہے جو تمام مختلف بنیادی امکانات کی نمائندگی کرتا ہے جو ایک امینو ایسڈ کو انکوڈ کرتے ہیں۔مخصوصیت کو بڑھانے کے لیے، آپ مختلف جانداروں کی بنیادی استعمال کی ترجیحات کے مطابق الحاق کو کم کرنے کے لیے کوڈن کے استعمال کے جدول کا حوالہ دے سکتے ہیں۔پرائمر کے اینیلنگ درجہ حرارت کو کم کرنے کے لیے ہائپوکسینتھائن کو تمام اڈوں کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے۔پرائمر کے 3′ سرے پر منسلک اڈوں کا استعمال نہ کریں کیونکہ 3′ کے آخر میں آخری 3 اڈوں کی اینیلنگ غلط جگہ پر PCR شروع کرنے کے لیے کافی ہے۔زیادہ پرائمر ارتکاز (1μM سے 3μM) استعمال کیا جاتا ہے کیونکہ بہت سے ملحقہ مرکب میں پرائمر ہدف کے سانچے کے لیے مخصوص نہیں ہوتے ہیں۔
پی سی آر خام مالاختیار
1. پرائمر کی مقدار
ہر پرائمر کا ارتکاز 0.1 ~ 1umol یا 10 ~ 100pmol ہے۔پرائمر کی سب سے کم مقدار کے ساتھ مطلوبہ نتیجہ پیدا کرنا بہتر ہے۔پرائمر کا زیادہ ارتکاز مماثلت اور غیر مخصوص امپلیفیکیشن کا سبب بنے گا، اور پرائمر کے درمیان ڈائمرز بننے کا امکان بڑھ جائے گا۔
2. پرائمر حراستی
پرائمر کا ارتکاز خصوصیت کو متاثر کرتا ہے۔پرائمر کی زیادہ سے زیادہ حراستی عام طور پر 0.1 اور 0.5μM کے درمیان ہوتی ہے۔اعلیٰ پرائمر ارتکاز غیر مخصوص مصنوعات کی افزائش کا باعث بنتے ہیں۔
3. پرائمر کا اینیلنگ درجہ حرارت
پرائمر کے لیے ایک اور اہم پیرامیٹر پگھلنے کا درجہ حرارت (Tm) ہے۔یہ وہ درجہ حرارت ہے جب 50% پرائمر اور تکمیلی ترتیب کو ڈبل پھنسے ہوئے DNA مالیکیولز کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔پی سی آر اینیلنگ درجہ حرارت سیٹ کرنے کے لیے ٹی ایم کی ضرورت ہے۔مثالی طور پر، اینیلنگ کا درجہ حرارت ہدف کی ترتیب کے ساتھ پرائمر کی مؤثر اینیلنگ کو یقینی بنانے کے لیے کافی کم ہے، لیکن غیر مخصوص بائنڈنگ کو کم کرنے کے لیے کافی زیادہ ہے۔مناسب اینیلنگ درجہ حرارت 55 ℃ سے 70 ℃ تک۔اینیلنگ کا درجہ حرارت عام طور پر پرائمر کے Tm سے 5℃ کم رکھا جاتا ہے۔
Tm کو ترتیب دینے کے کئی فارمولے ہیں، جو استعمال شدہ فارمولے اور پرائمر کی ترتیب کے لحاظ سے بہت زیادہ مختلف ہوتے ہیں۔چونکہ زیادہ تر فارمولے ایک تخمینہ شدہ Tm قدر فراہم کرتے ہیں، تمام اینیلنگ درجہ حرارت صرف ایک نقطہ آغاز ہوتے ہیں۔متعدد رد عمل کا تجزیہ کرکے خصوصیت کو بہتر بنایا جاسکتا ہے جو آہستہ آہستہ اینیلنگ درجہ حرارت کو بڑھاتے ہیں۔تخمینہ شدہ Tm-5℃ سے نیچے شروع کریں، اور آہستہ آہستہ اینیلنگ درجہ حرارت کو 2℃ کے اضافے میں بڑھائیں۔اینیلنگ کا زیادہ درجہ حرارت پرائمر ڈائمرز اور غیر مخصوص مصنوعات کی تشکیل کو کم کر دے گا۔بہترین نتائج کے لیے، دونوں پرائمر میں Tm کی تخمینی قدر ہونی چاہیے۔اگر پرائمر کے جوڑوں کا Tm فرق 5℃ سے زیادہ ہے تو، پرائمر سائیکل میں کم اینیلنگ درجہ حرارت کا استعمال کرتے ہوئے ایک اہم غلط آغاز دکھائیں گے۔اگر دو پرائمر Tm مختلف ہیں تو اینیلنگ کا درجہ حرارت 5℃ کم ترین Tm سے کم پر سیٹ کریں۔متبادل کے طور پر، مخصوصیت کو بڑھانے کے لیے، پانچ چکر پہلے زیادہ Tm کے لیے ڈیزائن کیے گئے اینیلنگ درجہ حرارت پر کیے جا سکتے ہیں، اس کے بعد باقی سائیکلوں کو کم Tm کے لیے ڈیزائن کیے گئے اینیلنگ درجہ حرارت پر کیا جا سکتا ہے۔یہ منزل کے سانچے کی ایک جزوی کاپی کو سخت حالات میں حاصل کرنے کی اجازت دیتا ہے۔
4. پرائمر طہارت اور استحکام
زیادہ تر پی سی آر ایپلی کیشنز کے لیے حسب ضرورت پرائمر کی معیاری پاکیزگی کافی ہے۔benzoyl اور isobutylyl گروپوں کو ڈیسالٹنگ کے ذریعے ہٹانا کم سے کم ہے اور اس لیے PCR میں مداخلت نہیں کرتا۔کچھ ایپلی کیشنز کو ترکیب کے عمل میں کسی بھی غیر مکمل لمبائی کے سلسلے کو ہٹانے کے لیے طہارت کی ضرورت ہوتی ہے۔یہ کٹے ہوئے سلسلے اس لیے ہوتے ہیں کیونکہ ڈی این اے ترکیب کیمسٹری کی کارکردگی 100% نہیں ہے۔یہ ایک سرکلر عمل ہے جو بار بار کیمیائی رد عمل کا استعمال کرتا ہے کیونکہ ہر بیس کو 3′ سے 5′ تک DNA بنانے کے لیے شامل کیا جاتا ہے۔آپ کسی بھی چکر میں ناکام ہو سکتے ہیں۔لمبے پرائمر، خاص طور پر وہ جو 50 سے زیادہ اڈوں سے زیادہ ہیں، کٹے ہوئے سلسلے کا ایک بڑا تناسب رکھتے ہیں اور انہیں صاف کرنے کی ضرورت پڑ سکتی ہے۔
پرائمر کی پیداوار مصنوعی کیمسٹری اور صاف کرنے کے طریقہ کار کی کارکردگی سے متاثر ہوتی ہے۔بائیو فارماسیوٹیکل کمپنیاں، جیسے سائٹولوجی اور شینگونگ، سبھی اولیگونوکلیوسائیڈ کی کل پیداوار کو یقینی بنانے کے لیے کم از کم OD یونٹ استعمال کرتی ہیں۔اپنی مرضی کے مطابق پرائمر خشک پاؤڈر کی شکل میں بھیجے جاتے ہیں۔TE میں پرائمر کو دوبارہ تحلیل کرنا بہتر ہے تاکہ حتمی ارتکاز 100μM ہو۔TE deionized پانی سے بہتر ہے کیونکہ پانی کا pH اکثر تیزابیت والا ہوتا ہے اور oligonucleosides کے hydrolysis کا سبب بنتا ہے۔
پرائمر کا استحکام ذخیرہ کرنے کے حالات پر منحصر ہے۔خشک پاؤڈر اور تحلیل شدہ پرائمر کو -20℃ پر ذخیرہ کیا جانا چاہیے۔TE میں 10μM سے زیادہ ارتکاز میں تحلیل ہونے والے پرائمر کو 6 ماہ کے لیے -20℃ پر مستحکم طور پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے، لیکن صرف کمرے کے درجہ حرارت (15℃ سے 30℃) پر 1 ہفتے سے کم کے لیے ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔خشک پاؤڈر پرائمر کو کم از کم 1 سال کے لیے -20 C پر اور کمرے کے درجہ حرارت (15 C سے 30 C) پر 2 ماہ تک ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔
5. انزائمز اور ان کا ارتکاز
فی الحال، Taq DNA پولیمریز کا استعمال کیا جاتا ہے بنیادی طور پر کولفورم بیکٹیریا کے ذریعہ ترکیب شدہ جین انجینئرنگ انزائم ہے۔ایک عام پی سی آر رد عمل کو متحرک کرنے کے لیے درکار انزائم کی مقدار تقریباً 2.5U ہے (100ul کے کل رد عمل کی مقدار سے مراد ہے)۔اگر ارتکاز بہت زیادہ ہے، تو یہ غیر مخصوص پرورش کا باعث بن سکتا ہے۔اگر ارتکاز بہت کم ہے تو مصنوعی مصنوعات کی مقدار کم ہو جائے گی۔
6. ڈی این ٹی پی کا معیار اور ارتکاز
ڈی این ٹی پی کے معیار کا پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی ارتکاز اور کارکردگی سے گہرا تعلق ہے۔dNTP پاؤڈر دانے دار ہوتا ہے، اور اگر اسے غلط طریقے سے ذخیرہ کیا جاتا ہے تو اس کا تغیر اپنی حیاتیاتی سرگرمی کھو دیتا ہے۔dNTP محلول تیزابیت والا ہے، اور اسے 1M NaOH یا 1M Tris.HCL بفر سلوشن کے ساتھ زیادہ ارتکاز میں استعمال کیا جانا چاہیے تاکہ اس کے PH کو 7.0 ~ 7.5 میں ایڈجسٹ کیا جا سکے، ذیلی پیکیجنگ کی تھوڑی مقدار، منجمد اسٹوریج -20℃ پر۔ایک سے زیادہ منجمد پگھلنا dNTP کو کم کردے گا۔PCR ردعمل میں، dNTP 50 ~ 200umol/L ہونا چاہیے۔خاص طور پر، چار DNTPS کی حراستی پر توجہ دی جانی چاہئے برابر ہونا چاہئے (مساوی تل کی تیاری).اگر ان میں سے کسی ایک کا ارتکاز دوسروں (اعلیٰ یا کم) سے مختلف ہے تو، مماثلت پیدا ہوگی۔بہت کم ارتکاز PCR مصنوعات کی پیداوار کو کم کر دے گا۔dNTP Mg2+ کے ساتھ مل سکتا ہے اور مفت Mg2+ کے ارتکاز کو کم کر سکتا ہے۔
7. ٹیمپلیٹ (ٹارگٹ جین) نیوکلک ایسڈ
ٹیمپلیٹ نیوکلک ایسڈ کی مقدار اور پیوریفیکیشن ڈگری پی سی آر کی کامیابی یا ناکامی کے کلیدی لنکس میں سے ایک ہے۔ڈی این اے صاف کرنے کے روایتی طریقے عام طور پر نمونوں کو ہضم کرنے اور ضائع کرنے کے لیے SDS اور پروٹیز K کا استعمال کرتے ہیں۔ایس ڈی ایس کے اہم کام یہ ہیں: خلیے کی جھلی پر لپڈز اور پروٹین کو تحلیل کرنا، اس طرح جھلی کے پروٹین کو تحلیل کرکے خلیے کی جھلی کو تباہ کرنا، اور خلیے میں جوہری پروٹین کو الگ کرنا، ایس ڈی ایس پروٹین کے ساتھ مل کر اور پریزیٹیٹ بھی کرسکتا ہے۔پروٹیز K پروٹین کو ہائیڈولائز اور ہضم کر سکتا ہے، خاص طور پر ڈی این اے کے ساتھ جڑے ہوئے ہسٹونز، اور پھر نامیاتی سالوینٹ فینول اور کلوروفارم کا استعمال پروٹین اور خلیے کے دوسرے اجزاء کو نکالنے کے لیے، اور نیوکلک ایسڈ کو تیز کرنے کے لیے ایتھنول یا آئسوپروپل الکحل کا استعمال کر سکتا ہے۔نکالا ہوا نیوکلک ایسڈ پی سی آر کے رد عمل کے نمونے کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔عام طبی پتہ لگانے کے نمونوں کے لیے، ایک فوری اور آسان طریقہ خلیات کو تحلیل کرنے، لیسیٹ پیتھوجینز، ہضم کرنے اور پروٹین کو کروموسوم سے آزاد ہدف جین تک ہٹانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، اور براہ راست PCR پروردن کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔RNA ٹیمپلیٹ نکالنے میں عام طور پر guanidine isothiocyanate یا protease K طریقہ استعمال کیا جاتا ہے تاکہ RNase کو RNA کو گرنے سے روکا جا سکے۔
8.Mg2+ ارتکاز
Mg2+ PCR ایمپلیفیکیشن کی مخصوصیت اور پیداوار پر ایک اہم اثر رکھتا ہے۔عام PCR ردعمل میں، جب مختلف dNTP کا ارتکاز 200umol/L ہے، Mg2+ کی مناسب ارتکاز 1.5 ~ 2.0mmol/L ہے۔Mg2+ کا ارتکاز بہت زیادہ ہے، رد عمل کی مخصوصیت کم ہو جاتی ہے، غیر مخصوص اضافہ ہوتا ہے، بہت کم ارتکاز Taq DNA پولیمریز کی سرگرمی کو کم کر دے گا، جس کے نتیجے میں رد عمل کی مصنوعات میں کمی واقع ہوتی ہے۔
میگنیشیم آئن پی سی آر کے کئی پہلوؤں کو متاثر کرتے ہیں، جیسے ڈی این اے پولیمریز سرگرمی، جو پیداوار کو متاثر کرتی ہے۔ایک اور مثال پرائمر اینیلنگ ہے، جو مخصوصیت کو متاثر کرتی ہے۔ڈی این ٹی پی اور ٹیمپلیٹ میگنیشیم آئن سے منسلک ہوتے ہیں، انزائم کی سرگرمی کے لیے ضروری مفت میگنیشیم آئن کی مقدار کو کم کرتے ہیں۔مختلف پرائمر جوڑوں اور ٹیمپلیٹس کے لیے بہترین میگنیشیم آئن کا ارتکاز مختلف ہوتا ہے، لیکن 200μM dNTP کے ساتھ ایک عام PCR شروع ہونے والا ارتکاز 1.5mM ہے (نوٹ: ریئل ٹائم مقداری PCR کے لیے، فلوروسینٹ پروب کے ساتھ 3 سے 5mM میگنیشیم آئن محلول استعمال کریں)۔مفت میگنیشیم آئنوں کی زیادہ ارتکاز پیداوار میں اضافہ کرتی ہے، لیکن غیر مخصوص وسعت میں بھی اضافہ کرتی ہے اور وفاداری کو کم کرتی ہے۔زیادہ سے زیادہ ارتکاز کا تعین کرنے کے لیے، میگنیشیم آئن ٹائٹریشنز 0.5mM کے اضافے میں 1mM سے 3mM تک کیے گئے۔میگنیشیم آئن کی اصلاح پر انحصار کو کم کرنے کے لیے، پلاٹینم ٹاک ڈی این اے پولیمریز استعمال کیا جا سکتا ہے۔پلاٹینم ٹاک ڈی این اے پولیمریز تاک ڈی این اے پولیمریز کے مقابلے میگنیشیم آئن کے ارتکاز کی ایک وسیع رینج پر کام کو برقرار رکھنے کے قابل ہے اور اس لیے اسے کم اصلاح کی ضرورت ہے۔
9. پی سی آر کو فروغ دینے والی اضافی چیزیں
اینیلنگ درجہ حرارت، پرائمر ڈیزائن، اور میگنیشیم آئن کے ارتکاز کی اصلاح زیادہ تر ٹیمپلیٹس کے انتہائی مخصوص امپلیفیکیشن کے لیے کافی ہے۔تاہم، کچھ ٹیمپلیٹس، بشمول اعلی GC مواد والے، اضافی اقدامات کی ضرورت ہے۔ڈی این اے کے پگھلنے والے درجہ حرارت کو متاثر کرنے والے اضافی اشیاء مصنوعات کی مخصوصیت اور پیداوار کو بہتر بنانے کا ایک اور طریقہ فراہم کرتے ہیں۔بہترین نتائج کے لیے ٹیمپلیٹ کی مکمل ڈینیچریشن درکار ہے۔
اس کے علاوہ، ثانوی ڈھانچہ پرائمر بائنڈنگ اور انزائم کی توسیع کو روکتا ہے۔
PCR additives، بشمول foramide, DMSO, glycerin, betaine, and PCRx Enhancer Solution, amplification کو بڑھاتے ہیں۔ان کا ممکنہ طریقہ کار پگھلنے والے درجہ حرارت کو کم کرنا ہے، اس طرح پرائمر کی اینیلنگ میں مدد کرنا اور ثانوی ڈھانچے کے علاقے کے ذریعے ڈی این اے پولیمریز کی توسیع میں مدد کرنا۔PCRx حل کے دیگر فوائد ہیں۔پلاٹینم ٹاک ڈی این اے پولیمریز اور پلاٹینم پی ایف ایکس ڈی این اے پولیمریز کے ساتھ استعمال ہونے پر کم سے کم میگنیشیم آئن کی اصلاح کی ضرورت ہوتی ہے۔اس طرح، تیسرے نقطہ نظر، میگنیشیم آئن کی اصلاح کے انحصار کو کم کرتے ہوئے، مخصوصیت کو بڑھانے کے لیے پلاٹینم تکنیک کو اضافی کے ساتھ ملایا جاتا ہے۔بہترین نتائج کے لیے، additives کے ارتکاز کو بہتر بنایا جانا چاہیے، خاص طور پر DMSO، فارمامائیڈ، اور گلیسرول، جو Taq DNA پولیمریز کو روکتے ہیں۔
10. گرم آغاز
ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر اچھے پرائمر ڈیزائن کے علاوہ پی سی آر کی مخصوصیت کو بہتر بنانے کے لیے سب سے اہم طریقوں میں سے ایک ہے۔اگرچہ Taq DNA پولیمریز کا زیادہ سے زیادہ لمبا درجہ حرارت 72℃ ہے، پولیمریز کمرے کے درجہ حرارت پر فعال رہتا ہے۔اس طرح، غیر مخصوص مصنوعات تیار کی جاتی ہیں جب پی سی آر رد عمل کی تیاری کے دوران اور تھرمل سائیکل کے آغاز میں ہولڈنگ کا درجہ حرارت اینیلنگ درجہ حرارت سے کم ہوتا ہے۔ایک بار بننے کے بعد، ان غیر مخصوص مصنوعات کو مؤثر طریقے سے بڑھا دیا جاتا ہے۔ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر خاص طور پر اس وقت موثر ہوتا ہے جب پرائمر ڈیزائن کے لیے استعمال ہونے والی سائٹیں جینیاتی عناصر کے محل وقوع کے لحاظ سے محدود ہوتی ہیں، جیسے کہ سائٹ پر مبنی تغیرات، ایکسپریشن کلوننگ، یا ڈی این اے انجینئرنگ کے لیے استعمال ہونے والے جینیاتی عناصر کی تعمیر اور ہیرا پھیری۔
Taq DNA پولیمریز کی سرگرمی کو محدود کرنے کا ایک عام طریقہ برف پر PCR ردعمل کا حل تیار کرنا اور اسے پہلے سے گرم PCR اپریٹس میں رکھنا ہے۔یہ طریقہ آسان اور سستا ہے، لیکن یہ انزائم کی سرگرمی کو مکمل نہیں کرتا ہے اور اس وجہ سے غیر مخصوص مصنوعات کی افزائش کو مکمل طور پر ختم نہیں کرتا ہے۔
تھرمل پرائمنگ ایک ضروری جزو کو روک کر ڈی این اے کی ترکیب میں تاخیر کرتی ہے جب تک کہ پی سی آر اپریٹس ڈینیچریشن درجہ حرارت تک نہ پہنچ جائے۔زیادہ تر دستی تھرمل شروع کرنے کے طریقے، بشمول Taq DNA پولیمریز میں تاخیر سے اضافہ، خاص طور پر ہائی تھرو پٹ ایپلی کیشنز کے لیے بوجھل ہیں۔دیگر تھرمل پرائمنگ طریقے ایک ضروری جزو کو بند کرنے کے لیے موم کی ڈھال کا استعمال کرتے ہیں، بشمول میگنیشیم آئنز یا انزائمز، یا جسمانی طور پر رد عمل والے اجزاء، جیسے ٹیمپلیٹس اور بفرز کو الگ تھلگ کرنے کے لیے۔تھرمل سائیکل کے دوران، موم کے پگھلنے کے ساتھ ہی مختلف اجزاء کو چھوڑ کر ایک ساتھ ملایا جاتا ہے۔دستی ہاٹ اسٹارٹ طریقہ کی طرح، ویکس شیلڈ کا طریقہ بوجھل اور آلودگی کا شکار ہے اور زیادہ تھرو پٹ ایپلی کیشنز کے لیے موزوں نہیں ہے۔
پلاٹینم ڈی این اے پولیمریز خودکار ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر کے لیے آسان اور موثر ہے۔پلاٹینم ٹاک ڈی این اے پولیمریز ریکومبیننٹ ٹاک ڈی این اے پولیمریز پر مشتمل ہوتا ہے جو ٹاک ڈی این اے پولیمریز کے خلاف مونوکلونل اینٹی باڈی کے ساتھ مل جاتا ہے۔اینٹی باڈیز پی سی آر کے ذریعہ تیار کی جاتی ہیں تاکہ طویل درجہ حرارت کے انعقاد کے دوران انزائم کی سرگرمی کو روکا جاسکے۔Taq DNA پولیمریز کو رد عمل میں 94℃ موصلیت کے عمل کے دوران جاری کیا گیا، جس سے پولیمریز کی مکمل سرگرمی بحال ہوئی۔تھرمل آغاز کے لیے کیمیائی طور پر تبدیل شدہ Taq DNA پولیمریز کے برعکس، پلاٹینم انزائم کو پولیمریز کو فعال کرنے کے لیے 94℃ (10 سے 15 منٹ) پر طویل موصلیت کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔PlatinumTaq DNA پولیمریز کے ساتھ، Taq DNA پولیمریز کی 90% سرگرمی 2 منٹ کے بعد 94℃ پر بحال ہوئی۔
11. Nest-PCR
نیسٹڈ پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے ایمپلیفیکیشن کے یکے بعد دیگرے راؤنڈ مخصوصیت اور حساسیت کو بہتر بنا سکتے ہیں۔پہلا راؤنڈ 15 سے 20 سائیکلوں کا معیاری امپلیفیکیشن ہے۔ابتدائی امپلیفیکیشن پروڈکٹ کا ایک چھوٹا سا حصہ 100 سے 1000 بار پتلا کیا گیا تھا اور 15 سے 20 سائیکلوں کے لئے ایمپلیفیکیشن کے دوسرے دور میں شامل کیا گیا تھا۔متبادل طور پر، ابتدائی ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کو جیل پیوریفیکیشن کے ذریعے سائز کیا جا سکتا ہے۔ایمپلیفیکیشن کے دوسرے دور میں ایک نیسٹڈ پرائمر استعمال کیا جاتا ہے، جو پہلے پرائمر کے اندر ہدف کی ترتیب سے منسلک ہو سکتا ہے۔نیسٹڈ پی سی آر کا استعمال متعدد ٹارگٹ سائٹس کے امپلیفیکیشن کے امکان کو کم کرتا ہے کیونکہ پرائمر کے دونوں سیٹوں کے لیے کچھ ٹارگٹ سیکونسز تکمیلی ہوتے ہیں۔ایک ہی پرائمر کے ساتھ سائیکلوں کی اتنی ہی کل تعداد (30 سے 40) نے غیر مخصوص سائٹوں کو بڑھا دیا۔نیسٹڈ پی سی آر محدود ہدف کی ترتیب (مثلاً نایاب مرنا) کی حساسیت کو بڑھاتا ہے اور مشکل پی سی آر ایس (مثلاً 5′ ریس) کی خصوصیت کو بہتر بناتا ہے۔
12. نزولی پی سی آر
پی سی آر کے پہلے چند چکروں کے لیے سخت اینیلنگ کنڈیشنز کا استعمال کرتے ہوئے ڈیسنڈنگ پی سی آر مخصوصیت کو بہتر بناتا ہے۔سائیکل ایک اینیلنگ درجہ حرارت پر شروع ہوتا ہے جو تخمینہ شدہ Tm سے تقریباً 5 ℃ زیادہ ہوتا ہے، پھر ہر سائیکل کو 1℃ سے 2℃ تک کم کیا جاتا ہے جب تک کہ اینیلنگ کا درجہ حرارت Tm 5℃ سے کم نہ ہو جائے۔صرف منزل کا سانچہ جس میں اعلیٰ ہم آہنگی ہو گی کو بڑھایا جائے گا۔یہ پراڈکٹس بعد کے چکروں میں پھیلتی رہتی ہیں، جس سے غیر مخصوص مصنوعات کی تعداد بڑھ جاتی ہے۔ڈیسنڈنگ پی سی آر ان طریقوں کے لیے مفید ہے جہاں پرائمر اور ٹارگٹ ٹیمپلیٹ کے درمیان ہومولوجی کی ڈگری معلوم نہ ہو، جیسے AFLP DNA فنگر پرنٹنگ۔
متعلقہ پی سی آر کٹس
2 × پی سی آر ہیروTMمکس سسٹم میں عام پی سی آر مکس سسٹم کے مقابلے میں پی سی آر روکنے والوں کے لیے زیادہ رواداری ہے، اور یہ مختلف پیچیدہ ٹیمپلیٹس کے پی سی آر ایمپلیفیکیشن سے آسانی سے نمٹ سکتا ہے۔منفرد رد عمل کا نظام اور اعلی کارکردگی Taq Hero پی سی آر کے رد عمل کو اعلی افادیت، مخصوصیت اور حساسیت کا حامل بناتا ہے۔
اعلی پروردن کی کارکردگی
اس میں 5'→3' DNA پولیمریز سرگرمی اور 5'→3' exonuclease سرگرمی ہے، بغیر 3'→5' exonuclease سرگرمی۔
ریئل ٹائم PCR Easyᵀᴹ-SYBR گرین I کٹ
مخصوص—آپٹمائزڈ بفر اور ہاٹ اسٹارٹ Taq انزائم غیر مخصوص ایمپلیفیکیشن اور پرائمر ڈائمر کی تشکیل کو روک سکتے ہیں۔
اعلی حساسیت - ٹیمپلیٹ کی کم کاپیوں کا پتہ لگاسکتی ہے۔
کٹ میں ایک منفرد Foregene ریورس ٹرانسکرپشن ریجنٹ اور Foregene HotStar Taq DNA Polymerase کا استعمال کیا گیا ہے جو کہ ایک منفرد رد عمل کے نظام کے ساتھ مل کر ردعمل کی افادیت اور مخصوصیت کو مؤثر طریقے سے بہتر بناتا ہے۔
پوسٹ ٹائم: مئی 09-2023
