• پی سی آر ایک ایسا طریقہ ہے جو ڈی این اے ٹیمپلیٹ کی تھوڑی مقدار سے ڈی این اے کو بڑھانے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔RT-PCR ریورس ٹرانسکرپشن کا استعمال کرتے ہوئے RNA ذریعہ سے DNA ٹیمپلیٹ تیار کرتا ہے جسے پھر بڑھایا جا سکتا ہے۔
• PCR اور RT-PCR عام طور پر اختتامی رد عمل ہیں، جبکہ qPCR اور RT-qPCR PCR کے رد عمل کے دوران مصنوعات کی ترکیب کی شرح کے حرکیات کا استعمال کرتے ہیں تاکہ موجود ٹیمپلیٹ کی مقدار کو درست کیا جا سکے۔
• نئے طریقے، جیسے ڈیجیٹل پی سی آر، ابتدائی ڈی این اے ٹیمپلیٹ کی قطعی مقدار فراہم کرتے ہیں، جبکہ آئیسو تھرمل پی سی آر جیسے طریقے قابل اعتماد نتائج فراہم کرنے کے لیے مہنگے آلات کی ضرورت کو کم کرتے ہیں۔

پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) ڈی این اے اور آر این اے کی ترتیب کو بڑھانے اور ان کا پتہ لگانے کے لیے نسبتاً آسان اور وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والی مالیکیولر بائیولوجی تکنیک ہے۔ڈی این اے کلوننگ اور ایمپلیفیکیشن کے روایتی طریقوں کے مقابلے، جس میں اکثر دن لگ سکتے ہیں، پی سی آر کو صرف چند گھنٹے درکار ہوتے ہیں۔پی سی آر انتہائی حساس ہے اور اسے مخصوص ترتیبوں کا پتہ لگانے اور بڑھانے کے لیے کم سے کم ٹیمپلیٹ کی ضرورت ہوتی ہے۔پی سی آر کے بنیادی طریقے سادہ ڈی این اے اور آر این اے کا پتہ لگانے سے مزید ترقی کر چکے ہیں۔ذیل میں، ہم نے مختلف پی سی آر طریقوں اور ری ایجنٹس کا ایک جائزہ فراہم کیا ہے جو ہم آپ کی تحقیقی ضروریات کے لیے Enzo Life Sciences میں فراہم کرتے ہیں۔ہمارا مقصد سائنسدانوں کو ان کے اگلے تحقیقی منصوبے میں استعمال کرنے کے لیے PCR ریجنٹس تک فوری رسائی میں مدد کرنا ہے!

پی سی آر

معیاری پی سی آر کے لیے، آپ کو صرف ڈی این اے پولیمریز، میگنیشیم، نیوکلیوٹائڈز، پرائمر، ڈی این اے ٹیمپلیٹ کو بڑھانا، اور تھرمو سائکلر کی ضرورت ہے۔پی سی آر کا طریقہ کار اتنا ہی آسان ہے جتنا کہ اس کا مقصد ہے: 1) ڈبل سٹرینڈڈ ڈی این اے (dsDNA) ہیٹ ڈینیچرڈ ہے، 2) پرائمر سنگل ڈی این اے اسٹرینڈز کے ساتھ منسلک ہوتے ہیں، اور 3) پرائمر ڈی این اے پولیمریز کے ذریعے بڑھائے جاتے ہیں، جس کے نتیجے میں اس کی دو کاپیاں بنتی ہیں۔ اصل ڈی این اے اسٹرینڈ۔درجہ حرارت اور اوقات کی ایک سیریز میں ڈینیچریشن، اینیلنگ، اور لمبا ہونے کے عمل کو ایمپلیفیکیشن کے ایک چکر کے طور پر جانا جاتا ہے (تصویر 1)۔

سائیکل کے ہر قدم کو استعمال شدہ ٹیمپلیٹ اور پرائمر سیٹ کے لیے بہتر بنایا جانا چاہیے۔اس سائیکل کو تقریباً 20-40 بار دہرایا جاتا ہے، اور پھر وسیع شدہ مصنوعات کا تجزیہ کیا جا سکتا ہے، عام طور پر ایگرز جیل (تصویر 2)۔

چونکہ پی سی آر ایک انتہائی حساس طریقہ ہے اور ایک رد عمل کے لیے بہت کم مقدار کی ضرورت ہوتی ہے، اس لیے متعدد رد عمل کے لیے ماسٹر مکس کی تیاری کی سفارش کی جاتی ہے۔ماسٹر مکس کو اچھی طرح سے ملایا جانا چاہیے اور پھر رد عمل کی تعداد کے حساب سے تقسیم کیا جانا چاہیے، اس بات کو یقینی بناتے ہوئے کہ ہر رد عمل میں یکساں مقدار میں انزائم، ڈی این ٹی پیز اور پرائمر شامل ہوں۔بہت سے سپلائرز، جیسے Enzo Life Sciences، PCR مکسز بھی پیش کرتے ہیں جن میں پرائمر اور DNA ٹیمپلیٹ کے علاوہ سب کچھ پہلے سے موجود ہوتا ہے۔

Guanine/Cytosine سے بھرپور (GC سے بھرپور) خطے معیاری PCR تکنیکوں میں ایک چیلنج کی نمائندگی کرتے ہیں۔GC سے بھرپور ترتیبیں کم GC مواد والی ترتیب سے زیادہ مستحکم ہوتی ہیں۔مزید برآں، GC سے بھرپور ترتیب ثانوی ڈھانچے کی تشکیل کرتی ہے، جیسے ہیئرپین لوپس۔نتیجے کے طور پر، ڈینیچریشن مرحلے کے دوران GC سے بھرپور ڈبل اسٹرینڈ کو مکمل طور پر الگ کرنا مشکل ہے۔نتیجتاً، ڈی این اے پولیمریز بغیر کسی رکاوٹ کے نئے اسٹرینڈ کی ترکیب نہیں کر سکتا۔ایک اعلی ڈینیچریشن درجہ حرارت اس کو بہتر بنا سکتا ہے، اور اینیلنگ کے اعلی درجہ حرارت اور کم اینیلنگ وقت کی طرف ایڈجسٹمنٹ GC سے بھرپور پرائمر کی غیر مخصوص پابندی کو روک سکتی ہے۔اضافی ریجنٹس GC سے بھرپور ترتیب کو بڑھا سکتے ہیں۔ڈی ایم ایس او، گلیسرول، اور بیٹین ثانوی ڈھانچے میں خلل ڈالنے میں مدد کرتے ہیں جو جی سی کے تعاملات کی وجہ سے ہوتے ہیں اور اس طرح ڈبل اسٹرینڈ کو الگ کرنے میں سہولت فراہم کرتے ہیں۔

ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر

غیر مخصوص امپلیفیکیشن ایک مسئلہ ہے جو پی سی آر کے دوران ہوسکتا ہے۔زیادہ تر ڈی این اے پولیمریز جو پی سی آر کے لیے استعمال ہوتے ہیں 68 ° C سے 72 ° C کے درمیان درجہ حرارت پر بہترین کام کرتے ہیں۔تاہم، انزائم کم درجہ حرارت پر بھی فعال ہو سکتا ہے، اگرچہ کم ڈگری تک۔اینیلنگ درجہ حرارت سے بہت نیچے کے درجہ حرارت پر، پرائمر غیر مخصوص طور پر باندھ سکتے ہیں اور غیر مخصوص امپلیفیکیشن کا باعث بن سکتے ہیں، چاہے رد عمل برف پر قائم ہو۔پولیمریز انحیبیٹرز کے استعمال سے اس کو روکا جا سکتا ہے جو ڈی این اے پولیمریز سے صرف ایک بار ایک مخصوص درجہ حرارت تک پہنچنے کے بعد الگ ہو جاتے ہیں، اس لیے ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر کی اصطلاح ہے۔روکنے والا ایک اینٹی باڈی ہو سکتا ہے جو پولیمریز اور ڈینیچرز کو ابتدائی ڈینیچریشن درجہ حرارت (عام طور پر 95°C) پر باندھتا ہے۔

ہائی فیڈیلیٹی پولیمریز

جب کہ ڈی این اے پولیمریز اصل ٹیمپلیٹ کی ترتیب میں کافی حد تک درست طریقے سے بڑھا دیتے ہیں، نیوکلیوٹائڈ ملاپ میں غلطیاں ہو سکتی ہیں۔کلوننگ جیسی ایپلی کیشنز میں مماثلت کے نتیجے میں تراشے ہوئے ٹرانسکرپٹس، اور غلط ترجمہ شدہ یا غیر فعال پروٹین نیچے کی طرف ہو سکتے ہیں۔ان مماثلتوں سے بچنے کے لیے، "پروف ریڈنگ" سرگرمی کے ساتھ پولیمیریز کی نشاندہی کی گئی ہے اور ورک فلو میں شامل کیا گیا ہے۔پہلی پروف ریڈنگ پولیمریز Pfu کی شناخت 1991 میں Pyrococcus furiosus میں ہوئی تھی۔اس Pfu انزائم میں 3' سے 5' exonuclease سرگرمی ہوتی ہے۔جیسا کہ ڈی این اے کو بڑھایا جاتا ہے، ایکسونوکلیز اسٹرینڈ کے 3' سرے پر غیر مماثل نیوکلیوٹائڈز کو ہٹاتا ہے۔اس کے بعد صحیح نیوکلیوٹائڈ کو تبدیل کیا جاتا ہے، اور ڈی این اے کی ترکیب جاری رہتی ہے۔غلط نیوکلیوٹائڈ تسلسل کی شناخت انزائم کے ساتھ صحیح نیوکلیوسائیڈ ٹرائی فاسفیٹ کے پابند تعلق پر مبنی ہے، جہاں غیر موثر پابندی ترکیب کو سست کر دیتی ہے اور صحیح متبادل کی اجازت دیتی ہے۔Pfu پولیمریز کی پروف ریڈنگ سرگرمی کے نتیجے میں Taq DNA پولیمریز کے مقابلے میں حتمی ترتیب میں کم غلطیاں ہوتی ہیں۔حالیہ برسوں میں، دیگر پروف ریڈنگ انزائمز کی نشاندہی کی گئی ہے، اور ڈی این اے ایمپلیفیکیشن کے دوران غلطی کی شرح کو مزید کم کرنے کے لیے اصل Pfu انزائم میں ترمیم کی گئی ہے۔

RT-PCR

ریورس ٹرانسکرپشن PCR، یا RT-PCR، RNA کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ایک اضافی قدم آر این اے کا پتہ لگانے اور بڑھانے کی اجازت دیتا ہے۔RNA کو معکوس ٹرانسکرپٹیس کا استعمال کرتے ہوئے، تکمیلی DNA (cDNA) میں الٹا نقل کیا جاتا ہے۔آر این اے ٹیمپلیٹ کا معیار اور پاکیزگی RT-PCR کی کامیابی کے لیے ضروری ہے۔RT-PCR کا پہلا مرحلہ DNA/RNA ہائبرڈ کی ترکیب ہے۔ریورس ٹرانسکرپٹیس میں RNase H فنکشن بھی ہوتا ہے، جو ہائبرڈ کے RNA حصے کو کم کرتا ہے۔اس کے بعد واحد پھنسے ہوئے ڈی این اے مالیکیول کو ڈی این اے پر منحصر ڈی این اے پولیمریز سرگرمی کے ذریعے سی ڈی این اے میں ریورس ٹرانسکرپٹیز مکمل کیا جاتا ہے۔فرسٹ اسٹرینڈ ری ایکشن کی کارکردگی امپلیفیکیشن کے عمل کو متاثر کر سکتی ہے۔یہاں سے، معیاری PCR طریقہ کار cDNA کو بڑھانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔RT-PCR کے ذریعے RNA کو cDNA میں تبدیل کرنے کے امکان کے بہت سے فوائد ہیں، اور یہ بنیادی طور پر جین کے اظہار کے تجزیہ کے لیے استعمال ہوتا ہے۔RNA سنگل پھنسے ہوئے اور بہت غیر مستحکم ہے، جس کی وجہ سے اس کے ساتھ کام کرنا مشکل ہوتا ہے۔یہ عام طور پر کیو پی سی آر میں پہلے قدم کے طور پر کام کرتا ہے، جو حیاتیاتی نمونے میں آر این اے ٹرانسکرپٹس کی مقدار درست کرتا ہے۔

qPCR اور RT-qPCR

Quantitative PCR (qPCR) کا استعمال متعدد ایپلی کیشنز کے لیے نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے، ان کی خصوصیات اور مقدار درست کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔RT-qPCR میں، RNA ٹرانسکرپٹس کو اکثر پہلے cDNA میں ریورس ٹرانسکرائب کرکے مقدار درست کی جاتی ہے، جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، اور پھر qPCR کو بعد میں کیا جاتا ہے۔جیسا کہ معیاری پی سی آر میں، ڈی این اے کو تین دہرائے جانے والے مراحل سے بڑھایا جاتا ہے: ڈینیچریشن، اینیلنگ، اور لمبا ہونا۔تاہم، کیو پی سی آر میں، فلوروسینٹ لیبلنگ پی سی آر کی ترقی کے ساتھ ڈیٹا کو جمع کرنے کے قابل بناتی ہے۔دستیاب طریقوں اور کیمسٹریوں کی حد کی وجہ سے اس تکنیک کے بہت سے فوائد ہیں۔

ڈائی پر مبنی کیو پی سی آر (عام طور پر سبز) میں، فلوروسینٹ لیبلنگ ڈی ایس ڈی این اے بائنڈنگ ڈائی کے استعمال سے ایمپلیفائیڈ ڈی این اے مالیکیولز کی مقدار درست کرنے کی اجازت دیتی ہے۔ہر سائیکل کے دوران، فلوروسینس ماپا جاتا ہے.فلوروسینس سگنل نقل شدہ ڈی این اے کی مقدار کے تناسب سے بڑھتا ہے۔لہذا، ڈی این اے کو "حقیقی وقت" (تصویر 3) میں مقدار کا تعین کیا جاتا ہے۔ڈائی پر مبنی کیو پی سی آر کے نقصانات یہ ہیں کہ ایک وقت میں صرف ایک ہدف کی جانچ کی جا سکتی ہے اور یہ کہ ڈائی نمونے میں موجود کسی بھی ds-DNA سے جڑے گا۔

پروب پر مبنی کیو پی سی آر میں، ہر ایک نمونے میں بیک وقت بہت سے اہداف کا پتہ لگایا جا سکتا ہے، لیکن اس کے لیے پرائمر کے علاوہ استعمال کیے جانے والے ہدف کے لیے مخصوص پروب کی اصلاح اور ڈیزائن کی ضرورت ہوتی ہے۔کئی قسم کے پروب ڈیزائن دستیاب ہیں، لیکن سب سے عام قسم ہائیڈرولیسس پروب ہے، جس میں فلوروفور اور بجھانے والا شامل ہوتا ہے۔فلوروسینس ریزوننس انرجی ٹرانسفر (FRET) بجھانے والے کے ذریعے فلوروفور کے اخراج کو روکتا ہے جبکہ تحقیقات برقرار ہے۔تاہم، پی سی آر کے رد عمل کے دوران، پرائمر کی توسیع کے دوران تحقیقات کو ہائیڈولائز کیا جاتا ہے اور اس مخصوص ترتیب کو بڑھانا جس کا یہ پابند ہے۔پروب کی کلیویج فلوروفور کو بجھانے والے سے الگ کرتی ہے اور اس کے نتیجے میں فلوروسینس میں اضافہ پر منحصر اضافہ ہوتا ہے (تصویر 4)۔اس طرح، تحقیقات پر مبنی کیو پی سی آر رد عمل سے فلوروسینس سگنل نمونے میں موجود تحقیقاتی ہدف کی ترتیب کی مقدار کے متناسب ہے۔چونکہ پروب پر مبنی کیو پی سی آر ڈائی پر مبنی کیو پی سی آر سے زیادہ مخصوص ہے، یہ اکثر کیو پی سی آر پر مبنی تشخیصی اسیسز میں استعمال ہونے والی ٹیکنالوجی ہے۔

Isothermal Amplification

پی سی آر مذکورہ بالا تکنیکوں کے لیے مہنگے تھرمو سائیکلنگ آلات کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ ڈینیچریشن، اینیلنگ اور توسیعی مراحل کے لیے چیمبر کے درجہ حرارت کو درست طریقے سے اوپر اور نیچے کیا جا سکے۔بہت سی تکنیکیں تیار کی گئی ہیں جن کو اس طرح کے قطعی آلات کی ضرورت نہیں ہے اور یہ سادہ پانی کے غسل میں یا دلچسپی کے خلیوں کے اندر بھی انجام دی جاسکتی ہیں۔ان تکنیکوں کو اجتماعی طور پر isothermal amplification کہا جاتا ہے اور یہ ایکسپونینشل، لکیری، یا cascade amplification پر مبنی کام کرتے ہیں۔

آئیسوتھرمل ایمپلیفیکیشن کی سب سے مشہور قسم لوپ میڈیٹڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن، یا ایل اے ایم پی ہے۔LAMP ٹیمپلیٹ ڈی این اے یا آر این اے کو بڑھانے کے لیے 65⁰C پر ایکسپونینشل ایمپلیفیکیشن کا استعمال کرتا ہے۔LAMP کو انجام دیتے وقت، نئے DNA کی ترکیب کے لیے DNA پولیمریز کے ساتھ ہدف والے DNA کے علاقوں کے لیے چار سے چھ پرائمر استعمال کیے جاتے ہیں۔ان میں سے دو پرائمر میں اعزازی ترتیب ہوتے ہیں جو دوسرے پرائمر میں ترتیب کو پہچانتے ہیں اور انہیں باندھتے ہیں، جس سے نئے ترکیب شدہ ڈی این اے میں ایک "لوپ" ڈھانچہ تشکیل پاتا ہے جو بعد میں پرورش کے بعد کے دوروں میں پرائمر اینیلنگ میں مدد کرتا ہے۔ایل اے ایم پی کو متعدد طریقوں سے تصور کیا جا سکتا ہے، بشمول فلوروسینس، ایگرز جیل الیکٹروفورسس، یا کلورمیٹری۔رنگین پیمائش کے ذریعہ مصنوع کی موجودگی یا عدم موجودگی کو دیکھنے اور معلوم کرنے میں آسانی اور درکار مہنگے آلات کی کمی نے LAMP کو ان علاقوں میں SARS-CoV-2 ٹیسٹنگ کے لیے ایک مناسب آپشن بنا دیا جہاں کلینکل لیب ٹیسٹنگ آسانی سے دستیاب نہیں تھی، یا نمونوں کی اسٹوریج اور نقل و حمل۔ قابل عمل نہیں تھا، یا ایسی لیبز میں جن میں پہلے PCR تھرمو سائیکلنگ کا سامان نہیں تھا۔