حال ہی میں، میں نے کچھ حیرت انگیز دریافت کیا!اس کے آس پاس کے بہت سے جدید تجربہ کار پیشہ ور افراد کچھ بہت ہی بنیادی تجرباتی علمی نکات کو بھی نہیں جانتے ہیں۔

مثال کے طور پر، کیا آپ درج ذیل سوالات کے جواب دے سکتے ہیں؟

کیا OD260 اور A260 میں کوئی فرق ہے؟ہر ایک کا کیا مطلب ہے؟
OD نظری کثافت (نظری کثافت) کا مخفف ہے، A جاذب (جذب) کا مخفف ہے، دونوں تصورات دراصل ایک جیسے ہیں، "نظری کثافت" "جذب" ہے، لیکن "نظری کثافت" زیادہ تر قومی معیارات کے مطابق ہے اور زیادہ معیاری ہے۔

عام طور پر ہم نیوکلک ایسڈ کے ارتکاز کا حساب لگانے کے لیے OD قدر کو 260nm پر ماپتے ہیں، تو 1OD کس چیز کی نمائندگی کرتا ہے؟
نیوکلک ایسڈ کی زیادہ سے زیادہ جذب کی چوٹی 260nm کی طول موج پر ہوتی ہے، جس میں DNA اور RNA دونوں ہوتے ہیں، نیز بکھرے ہوئے نیوکلک ایسڈ کے ٹکڑے (یہ اہم نکتہ ہے)۔
OD قدر 260 nm کی طول موج پر ماپا گیا OD260 کے طور پر ریکارڈ کیا گیا۔اگر نمونہ خالص ہے تو، OD260 قدر نیوکلک ایسڈ کے نمونے کے ارتکاز کا حساب لگا سکتی ہے۔
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (ڈبل پھنسے ہوئے DNA)
=37 μg/ml ssDNA (واحد پھنسے ہوئے DNA)
=40 μg/ml RNA
=30 μg/ml dNTPs (oligonucleotides)
کیا RT-PCR، Realtime-PCR اور QPCR کے درمیان کوئی تعلق اور فرق ہے؟
RT-PCR ریورس ٹرانسکرپشن PCR کے لیے مختصر ہے۔
ریئل ٹائم PCR=qPCR، مقداری ریئل ٹائم PCR کے لیے مختصر
اگرچہ ریئل ٹائم پی سی آر (ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری پی سی آر) اور ریورس ٹرانسکرپشن پی سی آر (ریورس ٹرانسکرپشن پی سی آر) دونوں کو مختصراً RT-PCR کہا جاتا ہے۔لیکن بین الاقوامی کنونشن یہ ہے: RT-PCR خاص طور پر ریورس ٹرانسکرپشن PCR سے مراد ہے۔

حیاتیات میں DNA/RNA کی لمبائی کو بیان کرنے کے لیے عام طور پر استعمال ہونے والے nt، bp، اور kb کیا ہیں؟
nt = نیوکلیوٹائڈ
bp = بیس جوڑا بیس جوڑا
kb = کلو بیس

یقینا، آپ کہیں گے کہ بہت سے لوگ ان چھوٹی تفصیلات کی پرواہ نہیں کرتے ہیں!ہر کوئی ایسا کرتا ہے، اور کوئی آپ سے نہیں پوچھے گا کہ یہ کیا ہے۔آپ جانتے ہیں کہ یہ غیر ضروری ہے، ٹھیک ہے؟

نہیں، نہیں، نہیں، یہ جاننا بہت ضروری ہے!جس کی وجہ سے؟
کیونکہ آپ ایک مضمون پوسٹ کرنا چاہتے ہیں!بھائی!چاہے آپ گریجویشن کا ارادہ کر رہے ہوں یا سائنسی تحقیقی کامیابیاں حاصل کر رہے ہوں، آپ کو بولنے کے لیے مضامین پر انحصار کرنا چاہیے!

نیوکلک ایسڈ نکالنا سب سے آسان اور بنیادی تجربہ ہونا چاہیے۔نیوکلک ایسڈ نکالنے کا معیار براہ راست بعد کے تجربات کے نتائج کا تعین کرتا ہے۔

اگرچہ میں اسے کئی بار کہہ چکا ہوں، پھر بھی بہت سے دوست ایسے ہیں جنہیں پرواہ نہیں ہے۔اس بار میں نے مضمون سے باہر جانے کا فیصلہ کیا!

مقداری ریئل ٹائم پی سی آر تجربات کی اشاعت کے لیے کم از کم معلومات، جسے MIQE کہا جاتا ہے۔, فلوروسینس مقداری تجرباتی رہنما خطوط کا ایک مجموعہ ہے جو بین الاقوامی سطح پر شروع کیا گیا ہے، جو فلوروسینس مقداری PCR تجربات کا جائزہ لینے اور مضامین شائع کرنے کے لیے ضروری تجرباتی معلومات کے لیے کم از کم معیارات تجویز کرتا ہے۔تجربہ کار کی طرف سے فراہم کردہ تجرباتی حالات اور تجزیہ کے طریقوں کے ذریعے، جائزہ لینے والے محقق کی تجرباتی اسکیم کی درستگی کا بہتر اندازہ لگا سکتے ہیں۔

یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ نیوکلک ایسڈ نکالنے کے حصے میں، مندرجہ ذیل پتہ لگانے والی اشیاء تجویز کی گئی ہیں،

"E" ایسی معلومات کی نشاندہی کرتا ہے جو فراہم کی جانی چاہیے اور "D" ایسی معلومات کی نشاندہی کرتا ہے جو اگر ضروری ہو تو فراہم کی جانی چاہیے۔

فارم بہت پیچیدہ ہے، حقیقت میں، میں یہ کہنا چاہتا ہوں کہ ہر کسی کو شروع کرنے کی ضرورت ہے

پاکیزگی (D)، پیداوار (D)، سالمیت (E) اور مستقل مزاجی (E) ان چار پہلوؤں میں نیوکلک ایسڈ کا جائزہ لینے کے لیے۔

تجرباتی عادات کے مطابق پہلے طہارت اور ارتکاز کے تشخیصی طریقوں کے بارے میں بات کریں۔

OD کی پیمائش تجربہ کاروں کے لیے پتہ لگانے کا پسندیدہ اور آسان طریقہ ہے۔جہاں تک اصول کا تعلق ہے، میں یہاں تفصیلات میں نہیں جاؤں گا۔بہت سی لیبارٹریز اب الٹرا مائیکرو سپیکٹرو فوٹومیٹر استعمال کرتی ہیں تاکہ نیوکلک ایسڈ کے نمونوں کا براہ راست مقداری تجزیہ کیا جا سکے۔جاذبیت کی قدر ظاہر کرتے ہوئے، پروگرام براہ راست ارتکاز کی قدر (نیوکلک ایسڈ، پروٹین اور فلوروسینٹ ڈائی) اور متعلقہ تناسب دیتا ہے۔جہاں تک OD قدر کے تجزیہ کا تعلق ہے، اس تصویر کو محفوظ کریں اور آپ ٹھیک ہو جائیں گے۔

یونیورسل OD قدر کے حل کی فہرست

تاہم، کچھ انتباہات ہیں جو آپ کے لیے الگ سے سامنے لانے کی ضرورت ہے۔

(آخر میں، میں جانتا ہوں کہ آپ کو وہ لوگ ہونا چاہئے جو بچت کرتے ہیں اور انتظار کرتے ہیں جب تک کہ آپ کو ان کی ضرورت نہ ہو!)

نوٹ 1 کا سامان

OD قدر مختلف آلات سے متاثر ہوگی۔جب تک OD260 ایک مخصوص حد کے اندر ہے، OD230 اور OD280 کی قدریں معنی خیز ہیں۔مثال کے طور پر، عام Eppendorf D30 کی 260nm پر جاذبیت کی حد 0~3A ہے، اور تھرمو کا NanoDrop One 260nm پر ہے۔جذب کی حد 0.5~62.5A۔

نوٹ 2کم کرنے والا ری ایجنٹ

OD قدر مختلف ری ایجنٹس کے گھٹانے سے متاثر ہو سکتی ہے۔مثال کے طور پر، pH میں پیوریفائیڈ RNA کی OD260/280 ریڈنگ7.5 10 ملی میٹر ٹریسبفر 1.9-2.1 کے درمیان ہے، جبکہ اندرغیر جانبدار آبی حلتناسب کم ہوگا، شاید صرف 1.8-2.0، لیکن اس کا مطلب یہ نہیں ہے کہ RNA کے معیار میں فرق ہوتا ہے۔

نوٹ 3بقایا مادہ

بقایا مادوں کا وجود نیوکلک ایسڈ کے ارتکاز کی پیمائش کی درستگی کو متاثر کرے گا، اس لیے ضروری ہے کہ نیوکلک ایسڈ کے نمونوں میں پروٹین، فینول، پولی سیکرائیڈ اور پولی فینول کی باقیات سے حتی الامکان پرہیز کیا جائے۔

تاہم، حقیقت میں، نامیاتی ریجنٹس کے ساتھ نکالنے کا ایک پرانا طریقہ ہے۔تجارتی کٹس میں، نکالنے کا اثر سنٹرفیوگریشن کے ساتھ مل کر سلیکا پر مبنی جذب کالم کے ذریعے حاصل کیا جا سکتا ہے، زہریلے اور نقصان دہ نامیاتی ری ایجنٹس سے بچنا جنہیں ہٹانا مشکل ہے، وغیرہ۔ مسئلہ، جیسے۔فورجین کی نیوکلک ایسڈ نکالنے والی کٹ، پورے آپریشن کے دوران DNase/RNase اور زہریلے نامیاتی ریجنٹس کا استعمال نہیں کرتی، تیز اور محفوظ, اوراثر ہےاچھی(حادثاتی طور پر کہا کہ یہ گنجا تھا، لیکن میں جانتا ہوں کہ آپ جاننا چاہتے ہیں)۔

مثال 1: جینومک DNA نکالنے کی پیداوار اور پاکیزگی

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) مختلف ذرائع سے مٹی کے نمونوں کا علاج کرتا ہے، اور حاصل کردہ جینومک DNA کی مقدار اور پاکیزگی کو درج ذیل جدول میں دکھایا گیا ہے:
مثال 2: ٹشو آر این اے نکالنے کی پیداوار اور پاکیزگی

اینیمل ٹوٹل آر این اے آئسولیشن کٹ (RE-03012) نے ٹشو کے مختلف نمونوں پر کارروائی کی، اور حاصل کردہ RNA کی مقدار اور پاکیزگی کو نیچے دیے گئے جدول میں دکھایا گیا ہے (ماؤس ٹشو کے لیے):
تاہم، یہ نہ سوچیں کہ آپ نے OD قدر کے ساتھ کام کر لیا ہے۔کیا آپ کے پاس ان اہم نکات کا خیال رکھنا ہے جو میں نے آپ کے سامنے پیش کیے ہیں؟

نوٹس

بکھرے ہوئے نیوکلک ایسڈ مالیکیولز کو بھی جذب میں شمار کیا جائے گا۔فرض کریں کہ آپ کے RNA میں جینومک ڈی این اے کی باقیات ہیں، آپ کی OD قدر بہت زیادہ دکھائی دے گی، لیکن RNA کی اصل حراستی کا تعین نہیں کیا جا سکتا۔آیا آپ کا آر این اے ہے یا نہیں یہ واضح نہیں ہے کہ انحطاط ہے یا نہیں، اس لیے ہمیں اب بھی زیادہ درست فیصلہ دینے کے لیے ایک جامع تشخیصی طریقہ کی ضرورت ہے، یعنی MIQE میں ذکر کردہ نیوکلک ایسڈ کی سالمیت کی تشخیص۔