1. بنیادی معلومات (اگر آپ تجرباتی حصہ دیکھنا چاہتے ہیں تو براہ کرم براہ راست دوسرے حصے میں منتقل کریں)

روایتی پی سی آر کے مشتق رد عمل کے طور پر، ریئل ٹائم پی سی آر بنیادی طور پر پی سی آر ایمپلیفیکیشن ری ایکشن کے ہر چکر میں ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ کی مقدار کی تبدیلی کو اصل وقت میں فلوروسینس سگنل کی تبدیلی کے ذریعے مانیٹر کرتا ہے، اور سی ٹی ویلیو اور معیاری وکر کے درمیان تعلق کے ذریعے ابتدائی ٹیمپلیٹ کا مقداری تجزیہ کرتا ہے۔

RT-PCR کے مخصوص ڈیٹا یہ ہیں۔بیس لائن, فلوروسینس کی حداورCt قدر

RT-PCR کے لیے عام لیبلنگ کے طریقے:

2. تجرباتی مراحل

2.1 تجرباتی گروپ بندی کے بارے میں- گروپ میں ایک سے زیادہ کنویں ہونے چاہئیں، اور حیاتیاتی تکرار ہونی چاہیے۔

2.2 پرائمر ڈیزائن کے اصول

①SiRNA پرجاتیوں کے لیے مخصوص ہے، اور مختلف انواع کے سلسلے مختلف ہوں گے۔

②SiRNA کو منجمد خشک پاؤڈر میں پیک کیا جاتا ہے، جسے کمرے کے درجہ حرارت پر 2-4 ہفتوں تک مستحکم طور پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔

2.3 ٹولز یا ری ایجنٹس جنہیں پہلے سے تیار کرنے کی ضرورت ہے۔

2.4 مخصوص تجرباتی مراحل میں ان مسائل کے بارے میں جن پر توجہ دینے کی ضرورت ہے:

①siRNA منتقلی کا عمل

1. چڑھانے کے لیے، آپ 24 کنویں پلیٹ، 12 کنویں پلیٹ یا 6 کنویں پلیٹ کا انتخاب کر سکتے ہیں (24 کنویں پلیٹ کے ہر کنویں میں تجویز کردہ اوسط RNA ارتکاز تقریباً 100-300 ng/uL ہے)، اور خلیات کی منتقلی کی بہترین کثافت %-80% تک ہے۔

2. منتقلی کے اقدامات اور مخصوص تقاضے سختی سے ہدایات کے مطابق ہیں۔

3. منتقلی کے بعد، mRNA کا پتہ لگانے (RT-PCR) یا 48-96 گھنٹے کے اندر پروٹین کا پتہ لگانے کے لیے نمونے 24-72 گھنٹے کے اندر جمع کیے جا سکتے ہیں (WB)

② آر این اے نکالنے کا عمل

1. خارجی خامروں کے ذریعہ آلودگی کو روکیں۔اس میں بنیادی طور پر سختی سے ماسک اور دستانے پہننا شامل ہے۔جراثیم سے پاک پائپیٹ ٹپس اور EP ٹیوبوں کا استعمال؛تجربے میں استعمال ہونے والا پانی RNase سے پاک ہونا چاہیے۔

2. فوری نکالنے والی کٹ میں تجویز کردہ کے مطابق دو بار کرنے کی سفارش کی جاتی ہے، جو واقعی پاکیزگی اور پیداوار کو بہتر بنائے گی۔

3. فضلہ مائع کو RNA کالم کو نہیں چھونا چاہیے۔

③ آر این اے کی مقدار

RNA نکالنے کے بعد، اس کی مقدار براہ راست Nanodrop کے ساتھ طے کی جا سکتی ہے، اور کم از کم ریڈنگ 10ng/ul تک کم ہو سکتی ہے۔

④ ٹرانسکرپشن کا عمل ریورس کریں۔

1. RT-qPCR کی زیادہ حساسیت کی وجہ سے، ہر نمونے کے لیے کم از کم 3 متوازی کنویں بنائے جائیں تاکہ بعد میں آنے والے Ct کو بہت زیادہ مختلف ہونے سے یا SD کو شماریاتی تجزیہ کے لیے بہت بڑا ہونے سے روکا جا سکے۔

2. ماسٹر مکس کو بار بار نہ جمائیں اور نہ پگھلیں۔

3. ہر ٹیوب/سوراخ کو ایک نئی ٹپ سے تبدیل کیا جانا چاہیے!نمونے شامل کرنے کے لیے ایک ہی پائپیٹ ٹپ کا مسلسل استعمال نہ کریں!

4. نمونہ شامل کرنے کے بعد 96 کنویں پلیٹ سے منسلک فلم کو پلیٹ کے ساتھ ہموار کرنے کی ضرورت ہے۔مشین پر ڈالنے سے پہلے سینٹرفیوج کرنا بہتر ہے، تاکہ ٹیوب کی دیوار پر موجود مائع نیچے بہہ سکے اور ہوا کے بلبلوں کو ہٹا سکے۔

⑤ عام منحنی تجزیہ

2.5 ڈیٹا کے تجزیہ کے بارے میں

کیو پی سی آر کے ڈیٹا کے تجزیے کو رشتہ دار مقدار اور مطلق مقدار میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔مثال کے طور پر، کنٹرول گروپ کے خلیات کے مقابلے علاج کے گروپ میں خلیات،

X جین کا mRNA کتنی بار تبدیل ہوتا ہے، یہ رشتہ دار مقدار ہے۔خلیوں کی ایک مخصوص تعداد میں، X جین کا mRNA

اس کی کتنی کاپیاں ہیں، یہ مطلق مقدار ہے۔عام طور پر جو ہم لیبارٹری میں سب سے زیادہ استعمال کرتے ہیں وہ رشتہ دار مقداری طریقہ ہے۔عام طور پر،2-ΔΔct طریقہتجربات میں سب سے زیادہ استعمال کیا جاتا ہے، لہذا یہاں صرف اس طریقہ کو تفصیل سے متعارف کرایا جائے گا۔

2-ΔΔct طریقہ: حاصل کردہ نتیجہ تجرباتی گروپ میں ٹارگٹ جین کے اظہار میں فرق ہے کنٹرول گروپ میں ہدف جین کی نسبت۔یہ ضروری ہے کہ ہدف جین اور اندرونی حوالہ جین دونوں کی افادیت کی افادیت 100٪ کے قریب ہو، اور رشتہ دار انحراف 5٪ سے زیادہ نہیں ہونا چاہئے۔

حساب کتاب کا طریقہ درج ذیل ہے:

Δct کنٹرول گروپ = کنٹرول گروپ میں ہدف جین کی ct قدر - کنٹرول گروپ میں اندرونی حوالہ جین کی ct قدر

Δct تجرباتی گروپ = تجرباتی گروپ میں ہدف جین کی ct قدر - تجرباتی گروپ میں اندرونی حوالہ جین کی ct قدر

ΔΔct=Δct تجرباتی گروپ-Δct کنٹرول گروپ

آخر میں، اظہار کی سطح میں فرق کے کثیر کا حساب لگائیں:

فولڈ = 2-ΔΔct تبدیل کریں (ایکسل فنکشن کے مطابق پاور ہے)

متعلقہ مصنوعات:

سیل ڈائریکٹ RT-qPCR کٹ