پی سی آر (پولیمریز چین ری ایکشن) ان وٹرو ڈی این اے ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجیز میں سے ایک ہے، جس کی تاریخ 30 سال سے زیادہ ہے۔

پی سی آر ٹکنالوجی کا آغاز 1983 میں سیٹس، یو ایس اے کے کیری ملس نے کیا۔ ملیس نے 1985 میں پی سی آر پیٹنٹ کے لیے درخواست دی اور اسی سال سائنس پر پہلا پی سی آر اکیڈمک پیپر شائع کیا۔ملس کو ان کے کام کے لیے 1993 میں کیمسٹری میں نوبل انعام سے نوازا گیا۔

پی سی آر کے بنیادی اصول

پی سی آر ہدف ڈی این اے کے ٹکڑوں کو دس لاکھ سے زیادہ گنا بڑھا سکتا ہے۔اصول ڈی این اے پولیمریز کے کیٹالیسس کے تحت ہے، پیرنٹ اسٹرینڈ ڈی این اے کو بطور ٹیمپلیٹ اور مخصوص پرائمر کو توسیع کے نقطہ آغاز کے طور پر استعمال کرنا ہے۔اسے وٹرو میں ڈینیچریشن، اینیلنگ اور ایکسٹینشن جیسے مراحل کے ذریعے نقل کیا جاتا ہے۔بیٹی اسٹرینڈ ڈی این اے کا عمل پیرنٹ اسٹرینڈ ٹیمپلیٹ ڈی این اے کی تکمیل کرتا ہے۔

معیاری پی سی آر عمل کو تین مراحل میں تقسیم کیا گیا ہے:

1. ڈینیچریشن: ڈی این اے ڈبل اسٹرینڈ کو الگ کرنے کے لیے اعلی درجہ حرارت کا استعمال کریں۔DNA ڈبل اسٹرینڈز کے درمیان ہائیڈروجن بانڈ اعلی درجہ حرارت (93-98℃) پر ٹوٹ جاتا ہے۔

2. اینیلنگ: ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے کو الگ کرنے کے بعد، درجہ حرارت کو کم کریں تاکہ پرائمر واحد پھنسے ہوئے ڈی این اے سے منسلک ہو سکے۔

3. توسیع: درجہ حرارت کم ہونے پر ڈی این اے پولیمریز پابند پرائمر سے ڈی این اے اسٹرینڈز کے ساتھ تکمیلی تاروں کی ترکیب کرنا شروع کر دیتا ہے۔جب توسیع مکمل ہوجاتی ہے، ایک سائیکل مکمل ہوجاتا ہے، اور ڈی این اے کے ٹکڑوں کی تعداد دوگنی ہوجاتی ہے۔

ان تینوں مراحل کو 25-35 بار بدلنے سے، ڈی این اے کے ٹکڑوں کی تعداد میں تیزی سے اضافہ ہوگا۔

پی سی آر کی آسانی یہ ہے کہ مختلف ٹارگٹ جینز کے لیے مختلف پرائمر ڈیزائن کیے جا سکتے ہیں، تاکہ ٹارگٹ جین کے ٹکڑوں کو مختصر وقت میں بڑھایا جا سکے۔

اب تک، پی سی آر کو تین قسموں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے، یعنی عام پی سی آر، فلوروسینٹ مقداری پی سی آر اور ڈیجیٹل پی سی آر۔

عام پی سی آر کی پہلی نسل

ٹارگٹ جین کو بڑھانے کے لیے ایک عام پی سی آر ایمپلیفیکیشن انسٹرومنٹ کا استعمال کریں، اور پھر پروڈکٹ کا پتہ لگانے کے لیے ایگروز جیل الیکٹروفورسس استعمال کریں، صرف کوالٹیٹیو تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔

پہلی نسل کے پی سی آر کے اہم نقصانات:

1. غیر مخصوص پروردن اور غلط مثبت نتائج کا شکار۔

2. پتہ لگانے میں کافی وقت لگتا ہے اور آپریشن بوجھل ہوتا ہے۔

3. صرف کوالٹیٹیو ٹیسٹ کیا جا سکتا ہے۔

دوسری نسل کا ریئل ٹائم پی سی آر

ریئل ٹائم پی سی آر، جسے کیو پی سی آر کے نام سے بھی جانا جاتا ہے، فلوروسینٹ پروبس کا استعمال کرتا ہے جو ری ایکشن سسٹم کی پیشرفت کی نشاندہی کر سکتے ہیں، اور فلوروسینٹ سگنلز کے جمع ہونے کے ذریعے ایمپلیفائیڈ پروڈکٹس کے جمع ہونے کی نگرانی کرتا ہے، اور فلوروسینٹ کریو کے ذریعے نتائج کا فیصلہ کرتا ہے۔Cq قدر اور معیاری وکر کی مدد سے اس کی مقدار درست کی جا سکتی ہے۔

چونکہ qPCR ٹیکنالوجی کو بند نظام میں انجام دیا جاتا ہے، اس لیے آلودگی کا امکان کم ہو جاتا ہے، اور مقداری پتہ لگانے کے لیے فلوروسینس سگنل کی نگرانی کی جا سکتی ہے، اس لیے یہ کلینیکل پریکٹس میں سب سے زیادہ استعمال ہوتی ہے اور PCR میں غالب ٹیکنالوجی بن گئی ہے۔

ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری PCR میں استعمال ہونے والے فلوروسینٹ مادوں کو اس میں تقسیم کیا جا سکتا ہے: TaqMan فلوروسینٹ پروب، مالیکیولر بیکنز اور فلوروسینٹ ڈائی۔

1) تقمان فلوروسینٹ تحقیقات:

پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے دوران، پرائمر کا ایک جوڑا شامل کرتے ہوئے ایک مخصوص فلوروسینٹ پروب شامل کی جاتی ہے۔تحقیقات ایک oligonucleotide ہے، اور دونوں سروں پر ایک رپورٹر فلوروسینٹ گروپ اور ایک quencher fluorescent گروپ کا لیبل لگا ہوا ہے۔

جب تحقیقات برقرار ہوتی ہے تو، رپورٹر گروپ کی طرف سے خارج ہونے والے فلوروسینٹ سگنل کو بجھانے والے گروپ کے ذریعے جذب کیا جاتا ہے۔پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے دوران، Taq انزائم کی 5′-3′ exonuclease سرگرمی تحقیقات کو ختم کر دیتی ہے، جس سے رپورٹر فلوروسینٹ گروپ اور بجھانے والا فلوروسینٹ گروپ کو الگ کر دیا جاتا ہے، تاکہ فلوروسینس مانیٹرنگ سسٹم فلوروسینس سگنل حاصل کر سکے، یعنی، ہر بار ایک ڈی این اے کی شکل میں ایک فلو اور فلو کی شکل ہوتی ہے۔ فلوروسینس سگنل کا جمع ہونا پی سی آر پروڈکٹ کی تشکیل کے ساتھ مکمل طور پر ہم آہنگ ہوتا ہے۔

2) SYBR فلوروسینٹ ڈائی:

پی سی آر ری ایکشن سسٹم میں، ایس وائی بی آر فلوروسینٹ ڈائی کی زیادتی شامل کی جاتی ہے۔SYBR فلوروسینٹ ڈائی کے غیر خاص طور پر DNA ڈبل اسٹرینڈ میں شامل ہونے کے بعد، یہ فلوروسینٹ سگنل خارج کرتا ہے۔SYBR ڈائی مالیکیول جو زنجیر میں شامل نہیں ہے وہ کسی فلوروسینٹ سگنل کو خارج نہیں کرے گا، اس طرح فلوروسینٹ سگنل کو یقینی بناتا ہے PCR مصنوعات میں اضافہ PCR مصنوعات میں اضافے کے ساتھ مکمل طور پر مطابقت رکھتا ہے۔SYBR صرف دوہرے پھنسے ہوئے DNA سے منسلک ہوتا ہے، اس لیے پگھلنے کی وکر کا استعمال اس بات کا تعین کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے کہ آیا PCR ردعمل مخصوص ہے۔

3) مالیکیولر بیکن:

یہ ایک اسٹیم لوپ ڈبل لیبل والا اولیگونوکلیوٹائڈ پروب ہے جو 5 اور 3 سروں پر تقریباً 8 بیسز کا ہیئرپین کا ڈھانچہ بناتا ہے۔دونوں سروں پر نیوکلک ایسڈ کی ترتیب مکمل طور پر جوڑ دی جاتی ہے، جس کی وجہ سے فلوروسینٹ گروپ اور بجھانے والا گروپ تنگ ہوتا ہے۔بند کریں، کوئی فلوروسینس پیدا نہیں کیا جائے گا۔

پی سی آر پروڈکٹ تیار ہونے کے بعد، اینیلنگ کے عمل کے دوران، مالیکیولر بیکن کے درمیانی حصے کو ایک مخصوص ڈی این اے ترتیب کے ساتھ جوڑا جاتا ہے، اور فلوروسینٹ جین کو مائدیپتی پیدا کرنے کے لیے بجھانے والے جین سے الگ کیا جاتا ہے۔

دوسری نسل کے پی سی آر کے اہم نقصانات:

حساسیت کا ابھی بھی فقدان ہے، اور کم نقل والے نمونوں کا پتہ لگانا غلط ہے۔

پس منظر کی قدر کا اثر ہے، اور نتیجہ مداخلت کے لیے حساس ہے۔

جب رد عمل کے نظام میں PCR inhibitors ہوتے ہیں، تو پتہ لگانے کے نتائج مداخلت کے لیے حساس ہوتے ہیں۔

تیسری نسل ڈیجیٹل پی سی آر

ڈیجیٹل پی سی آر (ڈیجیٹل پی سی آر، ڈی پی سی آر، ڈی آئی جی پی سی آر) اختتامی نقطہ کا پتہ لگانے کے ذریعے ہدف کی ترتیب کے کاپی نمبر کا حساب لگاتا ہے، اور اندرونی کنٹرول اور معیاری منحنی خطوط کا استعمال کیے بغیر درست مطلق مقداری پتہ لگا سکتا ہے۔

ڈیجیٹل پی سی آر اختتامی نقطہ کا پتہ لگانے کا استعمال کرتا ہے اور یہ Ct قدر (سائیکل تھریشولڈ) پر منحصر نہیں ہے، لہذا ڈیجیٹل پی سی آر رد عمل ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی سے کم متاثر ہوتا ہے، اور اعلی درستگی اور تولیدی صلاحیت کے ساتھ، پی سی آر ردعمل روکنے والوں کے لیے رواداری بہتر ہوتی ہے۔

اعلیٰ حساسیت اور اعلیٰ درستگی کی خصوصیات کی وجہ سے، اس میں پی سی آر رد عمل روکنے والے آسانی سے مداخلت نہیں کرتے، اور یہ معیاری مصنوعات کے بغیر حقیقی مطلق مقدار کو حاصل کر سکتا ہے، جو کہ ایک تحقیق اور اطلاق کا مرکز بن چکا ہے۔

ردعمل یونٹ کی مختلف شکلوں کے مطابق، اسے تین اہم اقسام میں تقسیم کیا جا سکتا ہے: مائیکرو فلائیڈک، چپ اور ڈراپلیٹ سسٹم۔

1) مائیکرو فلائیڈک ڈیجیٹل پی سی آر، ایم ڈی پی سی آر:

مائیکرو فلائیڈک ٹیکنالوجی کی بنیاد پر، ڈی این اے ٹیمپلیٹ کو الگ کیا جاتا ہے۔مائیکرو فلائیڈک ٹیکنالوجی نمونے کی نینو اپ گریڈنگ یا چھوٹی بوندوں کی نسل کو محسوس کر سکتی ہے، لیکن بوندوں کو جذب کرنے کے ایک خاص طریقہ کی ضرورت ہوتی ہے اور پھر اسے پی سی آر ری ایکشن سسٹم کے ساتھ ملایا جاتا ہے۔ایم ڈی پی سی آر کو بتدریج دوسرے طریقوں سے تبدیل کیا گیا ہے۔

2) قطرہ قطرہ پر مبنی ڈیجیٹل پی سی آر، ڈی ڈی پی سی آر:

نمونے کو بوندوں میں پروسیس کرنے کے لیے پانی میں تیل کی بوندیں پیدا کرنے والی ٹیکنالوجی کا استعمال کریں، اور نیوکلک ایسڈ مالیکیولز پر مشتمل ری ایکشن سسٹم کو ہزاروں نانوسکل بوندوں میں تقسیم کریں، جن میں سے ہر ایک میں نیوکلیک ایسڈ ہدف کے مالیکیول کا پتہ نہیں لگایا جا سکتا، یا ٹیسٹ کیے جانے کے لیے ایک سے کئی نیوکلیک ایسڈ ہدف مالیکیول پر مشتمل ہے۔

3) چپ پر مبنی ڈیجیٹل پی سی آر، سی ڈی پی سی آر:

سلکان ویفرز یا کوارٹج گلاس پر بہت سے مائیکرو ٹیوبز اور مائیکرو کیویٹیز کو کندہ کرنے کے لیے مربوط فلوڈ پاتھ وے ٹیکنالوجی کا استعمال کریں، اور مختلف کنٹرول والوز کے ذریعے محلول کے بہاؤ کو کنٹرول کریں، اور مکمل مقدار کے حصول کے لیے ڈیجیٹل پی سی آر ری ایکشن کے لیے نمونے کے مائع کو ایک ہی سائز کے نینو میٹرز میں ری ایکشن ویلز میں تقسیم کریں۔

تیسری نسل کے پی سی آر کے اہم نقصانات:

سامان اور ری ایجنٹ مہنگے ہیں۔

ٹیمپلیٹ کے معیار کے تقاضے زیادہ ہیں۔اگر ٹیمپلیٹ کی مقدار مائیکرو سسٹم کی مقدار سے زیادہ ہے، تو اس کی مقدار درست کرنا ناممکن ہو جائے گا، اور اگر یہ بہت چھوٹا ہے، تو مقدار کی درستگی کم ہو جائے گی۔

جب غیر مخصوص پروردن نہ ہو تو غلط مثبتات بھی پیدا ہو سکتے ہیں۔