ریئل ٹائم پی سی آر، جسے مقداری پی سی آر یا کیو پی سی آر بھی کہا جاتا ہے، پی سی آر ایمپلیفیکیشن پروڈکٹس کی ریئل ٹائم نگرانی اور تجزیہ کا ایک طریقہ ہے۔
چونکہ مقداری پی سی آر میں سادہ آپریشن، تیز اور آسان، اعلیٰ حساسیت، اچھی تکرار کی صلاحیت، اور آلودگی کی کم شرح کے فوائد ہیں، اس لیے یہ وسیع پیمانے پر طبی جانچ، منشیات کی افادیت کی تشخیص، جین ایکسپریشن ریسرچ، ٹرانسجینک ریسرچ، جین کا پتہ لگانے، پیتھوجین کا پتہ لگانے، جانوروں اور پودوں کی کھوج میں استعمال ہوتا ہے۔کھانے کی جانچ اور دیگر شعبوں۔
اس لیے، چاہے آپ لائف سائنسز میں بنیادی تحقیق میں مصروف ہوں، یا فارماسیوٹیکل کمپنیوں، جانوروں کی پالنے والی کمپنیوں، فوڈ کمپنیوں، یا یہاں تک کہ انٹری ایگزٹ انسپکشن اور قرنطینہ بیورو، ماحولیاتی نگرانی کے محکموں، ہسپتالوں اور دیگر یونٹوں کے ملازمین، آپ کو کم و بیش اس کا سامنا کرنا پڑے گا یا آپ کو PCR کوانٹ میں مہارت حاصل کرنے کے علم کی ضرورت ہے۔

ریئل ٹائم پی سی آر کا اصول

ریئل ٹائم پی سی آر ایک ایسا طریقہ ہے جس میں فلوروسینٹ مادوں کو پی سی آر ری ایکشن سسٹم میں شامل کیا جاتا ہے، اور پی سی آر ری ایکشن کے عمل میں فلوروسینس سگنل کی شدت کو ایک مقداری پی سی آر آلے کے ذریعے حقیقی وقت میں مانیٹر کیا جاتا ہے، اور آخر میں تجرباتی ڈیٹا کا تجزیہ کیا جاتا ہے اور اس پر کارروائی کی جاتی ہے۔

【ایمپلیفیکیشن وکر】پی سی آر کے متحرک عمل کو بیان کرنے والا وکر ہے۔پی سی آر کا ایمپلیفیکیشن وکر درحقیقت معیاری ایکسپونینشل وکر نہیں ہے، بلکہ ایک سگمائڈ وکر ہے۔

[پروردن وکر کا پلیٹ فارم مرحلہ]پی سی آر سائیکلوں کی تعداد میں اضافے کے ساتھ، ڈی این اے پولیمریز کا غیر فعال ہونا، ڈی این ٹی پیز اور پرائمر کی کمی، اور پروڈکٹ پائروفاسفیٹ وغیرہ کے رد عمل سے ترکیب کے رد عمل کی روک تھام، پی سی آر ہمیشہ تیزی سے نہیں پھیلتا۔، اور آخر کار ایک سطح مرتفع میں داخل ہوگا۔

ایمپلیفیکیشن وکر کا ایکسپونیشنل گروتھ ریجن]اگرچہ سطح مرتفع کا مرحلہ بہت مختلف ہوتا ہے، لیکن ایمپلیفیکیشن وکر کے ایکسپونینشل گروتھ ریجن کے ایک مخصوص علاقے میں، ریپیٹ ایبلٹی بہت اچھی ہے، جو پی سی آر کے مقداری تجزیہ کے لیے بہت اہم ہے۔

[تھریش ہولڈ ویلیو اور Ct ویلیو]ہم ایمپلیفیکیشن وکر کے ایکسپونینشل گروتھ ایریا میں مناسب پوزیشن پر فلوروسینس ڈٹیکشن کی حد قدر متعین کرتے ہیں، یعنی تھریشولڈ ویلیو (تھریشولڈ)۔تھریشولڈ ویلیو اور ایمپلیفیکیشن کریو کا انٹرسیکشن Ct ویلیو ہے، یعنی Ct ویلیو سے مراد سائیکلوں کی تعداد (تھریش ہولڈ سائیکل) ہے جب حد کی قدر پہنچ جاتی ہے۔

نیچے کا گراف واضح طور پر تھریشولڈ لائن اور ایمپلیفیکیشن کریو، تھریشولڈ اور Ct ویلیو کے درمیان تعلق کو ظاہر کرتا ہے۔

【مقدار کیسے طے کی جائے؟】

یہ ریاضیاتی تھیوری سے ثابت ہوا ہے کہ Ct ویلیو کا ابتدائی ٹیمپلیٹس کی تعداد کے لوگارتھم کے ساتھ ایک الٹا لکیری تعلق ہے۔ریئل ٹائم پی سی آر پی سی آر ایمپلیفیکیشن پراڈکٹس کو ریئل ٹائم میں مانیٹر کرتا ہے اور ایکسپونیشنل ایمپلیفیکیشن مرحلے کے دوران ان کی مقدار درست کرتا ہے۔

پی سی آر کے ہر چکر کے لیے، ڈی این اے میں تیزی سے 2 گنا اضافہ ہوا، اور جلد ہی سطح مرتفع تک پہنچ گیا۔

یہ فرض کرتے ہوئے کہ شروع ہونے والے DNA کی مقدار A ہے۔₀ ، n سائیکلوں کے بعد، DNA مصنوعات کی نظریاتی مقدار کو اس طرح ظاہر کیا جا سکتا ہے:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

پھر، ابتدائی ڈی این اے کی مقدار A 0 جتنی زیادہ ہوگی، اتنی ہی جلدی پروڈکٹ کی مقدار پتہ لگانے کی قدر تک پہنچ جائے گی، اور An تک پہنچنے پر سائیکلوں کی تعداد Ct قدر ہے۔یعنی، ابتدائی DNA کی مقدار A 0 جتنی زیادہ ہوگی، ایمپلیفیکیشن وکر کی چوٹی اتنی ہی پہلے ہوگی، اور اسی مناسبت سے سائیکلوں کی مطلوبہ تعداد n کم ہوگی۔

ہم معلوم ارتکاز کے معیار کی تدریجی کمی کو انجام دیتے ہیں اور اسے ریئل ٹائم پی سی آر کے نمونے کے طور پر استعمال کرتے ہیں، اور ڈی این اے کی مقدار کو کم سے شروع کرنے کی ترتیب میں برابر وقفوں پر ایمپلیفیکیشن کروز کا ایک سلسلہ حاصل کیا جائے گا۔Ct قدر اور ابتدائی ٹیمپلیٹس کی تعداد کے لوگارتھم کے درمیان لکیری تعلق کے مطابق، a[معیاری وکر] بنایا جا سکتا ہے۔

معیاری وکر میں نامعلوم ارتکاز کے ساتھ نمونے کی Ct قدر کی جگہ لے کر، نامعلوم ارتکاز کے ساتھ نمونے کی ابتدائی ٹیمپلیٹ رقم حاصل کی جا سکتی ہے، جو کہ ریئل ٹائم پی سی آر کا مقداری اصول ہے۔

ریئل ٹائم پی سی آر کا پتہ لگانے کا طریقہ

ریئل ٹائم پی سی آر ری ایکشن سسٹم میں فلوروسینس کی شدت کا پتہ لگا کر پی سی آر ایمپلیفیکیشن مصنوعات کا پتہ لگاتا ہے۔

فلوروسینٹ ڈائی ایمبیڈنگ طریقہ کا اصول】

فلوروسینٹ رنگجیسا کہ ٹی بی گرین ®، پی سی آر سسٹمز میں غیر مخصوص طور پر دوہرے پھنسے ہوئے ڈی این اے سے منسلک ہو سکتا ہے اور پابند ہونے پر فلوریسس۔

پی سی آر سائیکلوں میں اضافے کے ساتھ رد عمل کے نظام میں فلوروسینس کی شدت میں تیزی سے اضافہ ہوا۔فلوروسینس کی شدت کا پتہ لگا کر، ری ایکشن سسٹم میں ڈی این اے ایمپلیفیکیشن کی مقدار کو حقیقی وقت میں مانیٹر کیا جا سکتا ہے، اور پھر نمونے میں شروع ہونے والی ٹیمپلیٹ کی مقدار کا الٹا اندازہ لگایا جا سکتا ہے۔

【فلوروسینٹ تحقیقات کے طریقہ کار کا اصول】

فلوروسینٹ تحقیقاتایک نیوکلک ایسڈ کی ترتیب ہے جس میں 5′ کے آخر میں فلوروسینٹ گروپ اور 3′ اختتام پر بجھانے والا گروپ ہے، جو خاص طور پر ٹیمپلیٹ سے منسلک ہو سکتا ہے۔جب تحقیقات برقرار ہوتی ہے تو، فلوروفور کے ذریعہ خارج ہونے والے فلوروسینس کو بجھانے والے گروپ کے ذریعہ بجھایا جاتا ہے اور فلوروسینس نہیں ہوسکتا ہے۔جب پروب گل جائے گا، فلوروسینٹ مادہ الگ ہو جائے گا اور فلوروسینس خارج کرے گا۔

پی سی آر کے رد عمل کے حل میں فلوروسینٹ پروب شامل کی جاتی ہے۔اینیلنگ کے عمل کے دوران، فلوروسینٹ پروب ٹیمپلیٹ کی مخصوص پوزیشن سے منسلک ہو جائے گا۔توسیع کے عمل کے دوران، PCR انزائم کی 5′→3′ exonuclease سرگرمی ٹیمپلیٹ کے ساتھ ہائبرڈائزڈ فلوروسینٹ پروب کو گل سکتی ہے، اور فلوروسینٹ مادہ کو فلوروسینس خارج کرنے کے لیے الگ کر دیا جاتا ہے۔ری ایکشن سسٹم میں پروب کی فلوروسینس شدت کا پتہ لگا کر، پی سی آر پروڈکٹ کی ایمپلیفیکیشن رقم کی نگرانی کا مقصد حاصل کیا جا سکتا ہے۔

【فلوروسینس کا پتہ لگانے کے طریقہ کار کا انتخاب】

اگر اس کا استعمال ہائی ہومولوجی کے ساتھ ترتیب کو الگ کرنے اور ملٹی پلیکس پی سی آر کا پتہ لگانے جیسے SNP ٹائپنگ تجزیہ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے، تو فلوروسینٹ پروب کا طریقہ ناقابل تلافی ہے۔
دیگر ریئل ٹائم پی سی آر تجربات کے لیے، ایک سادہ، آسان اور کم لاگت والا فلوروسینٹ کیمیرا طریقہ استعمال کیا جا سکتا ہے۔

تحقیقات مضبوط خصوصیت، ملٹی پلیکس پی سی آر کے قابل

کوتاہی

امپلیفیکیشن کے لئے اعلی مخصوص ضروریات؛

ملٹی پلیکس پی سی آر کو انجام نہیں دیا جا سکتا مخصوص تحقیقات کو ڈیزائن کرنے کی ضرورت ہے، زیادہ قیمت؛

بعض اوقات تحقیقات کا ڈیزائن مشکل ہوتا ہے۔

متعلقہ مصنوعات: