ردعمل کے نظام کی حساسیت میں اضافہ:

1. اعلی معیار کے آر این اے کو الگ کریں:

سی ڈی این اے کی کامیاب ترکیب اعلیٰ معیار کے آر این اے سے آتی ہے۔اعلیٰ معیار کا RNA کم از کم مکمل طوالت کا اور ریورس ٹرانسکرپٹیس انابیٹرز جیسے EDTA یا SDS سے پاک ہونا چاہیے۔RNA کا معیار ترتیب کی معلومات کی زیادہ سے زیادہ مقدار کا تعین کرتا ہے جسے آپ cDNA میں نقل کر سکتے ہیں۔ایک عام RNA صاف کرنے کا طریقہ ایک قدمی طریقہ ہے جس میں guanidine isothiocyanate/ acid phenol کا استعمال کیا جاتا ہے۔RNase کی ٹریس مقدار کے ذریعے آلودگی کو روکنے کے لیے، RNase سے بھرپور نمونوں (جیسے لبلبہ) سے الگ تھلگ RNA کو اعلیٰ معیار کے RNA کو محفوظ رکھنے کے لیے، خاص طور پر طویل مدتی ذخیرہ کرنے کے لیے formaldehyde میں ذخیرہ کرنے کی ضرورت ہے۔چوہے کے جگر سے نکالا گیا آر این اے ایک ہفتے تک پانی میں ذخیرہ کرنے کے بعد بنیادی طور پر انحطاط پذیر ہو گیا تھا، جبکہ چوہے کی تلی سے نکالا جانے والا آر این اے 3 سال تک پانی میں ذخیرہ کرنے کے بعد مستحکم رہا۔اس کے علاوہ، 4 kb سے زیادہ لمبی ٹرانسکرپٹس چھوٹی ٹرانسکرپٹس کے مقابلے ٹریس RNases کے ذریعے انحطاط کے لیے زیادہ حساس ہوتی ہیں۔ذخیرہ شدہ RNA نمونوں کی استحکام کو بڑھانے کے لیے، RNA کو ڈیونائزڈ فارمامائیڈ میں تحلیل کیا جا سکتا ہے اور -70°C پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔آر این اے کو محفوظ کرنے کے لیے استعمال ہونے والی فارمامائڈ کو لازمی طور پر آر این اے کو کم کرنے والے ملبے سے پاک ہونا چاہیے۔لبلبہ سے آر این اے کو کم از کم ایک سال تک فارمامائیڈ میں محفوظ کیا جا سکتا ہے۔RNA استعمال کرنے کی تیاری کرتے وقت، آپ RNA کو تیز کرنے کے لیے درج ذیل طریقہ استعمال کر سکتے ہیں: NaCl کو 0.2M میں اور ایتھنول کے حجم سے 4 گنا، کمرے کے درجہ حرارت پر 3-5 منٹ کے لیے رکھیں، اور 5 منٹ کے لیے 10,000×g پر سینٹری فیوج کریں۔

2. RNaseH-inactive (RNaseH-) ریورس ٹرانسکرپٹیس کا استعمال کریں:

RNase inhibitors کو اکثر الٹ ٹرانسکرپشن ری ایکشنز میں شامل کیا جاتا ہے تاکہ cDNA کی ترکیب کی لمبائی اور پیداوار کو بڑھایا جا سکے۔RNase inhibitors کو ایک بفر اور کم کرنے والے ایجنٹ (جیسے DTT) کی موجودگی میں فرسٹ اسٹرینڈ ترکیب کے رد عمل کے دوران شامل کیا جانا چاہئے، کیونکہ cDNA کی ترکیب سے پہلے کا عمل روکتا ہے، اس طرح پابند RNase جاری کرتا ہے جو RNA کو کم کر سکتا ہے۔پروٹین RNase inhibitors صرف RNase A, B, C کے ذریعے RNA کے انحطاط کو روکتے ہیں اور RNase کو جلد پر نہیں روکتے، لہٰذا محتاط رہیں کہ ان انابیٹرز کے استعمال کے باوجود RNase کو اپنی انگلیوں سے متعارف نہ کروائیں۔

ریورس ٹرانسکرپٹیس آر این اے کو سی ڈی این اے میں تبدیل کرتا ہے۔M-MLV اور AMV دونوں میں ان کی اپنی پولیمریز سرگرمی کے علاوہ اینڈوجینس RNaseH سرگرمی ہے۔RNaseH سرگرمی اور پولیمریز سرگرمی RNA ٹیمپلیٹ اور DNA پرائمر یا cDNA ایکسٹینشن اسٹرینڈ کے درمیان بننے والے ہائبرڈ اسٹرینڈ کے لیے ایک دوسرے کے ساتھ مقابلہ کرتی ہے، اور RNA:DNA کمپلیکس میں RNA اسٹرینڈ کو کم کرتی ہے۔RNaseH سرگرمی کے ذریعہ تنزلی شدہ RNA ٹیمپلیٹ اب cDNA کی ترکیب کے لیے ایک مؤثر ذیلی ذخیرے کے طور پر کام نہیں کر سکتا، جو cDNA کی ترکیب کی پیداوار اور لمبائی کو کم کرتا ہے۔لہذا، ریورس ٹرانسکرپٹیس کی RNaseH سرگرمی کو ختم کرنا یا اسے بہت کم کرنا فائدہ مند ہوگا۔

SuperScript Ⅱ ریورس ٹرانسکرپٹیس، RNaseH- MMLV ریورس ٹرانسکرپٹیس اور تھرمو اسکرپٹ ریورس ٹرانسکرپٹیس، RNaseH- AMV، MMLV اور AMV سے زیادہ مقدار اور زیادہ مکمل لمبائی والا cDNA حاصل کر سکتا ہے۔RT-PCR کی حساسیت cDNA کی ترکیب کی مقدار سے متاثر ہوگی۔ThermoScript AMV سے زیادہ حساس ہے۔RT-PCR مصنوعات کا سائز سی ڈی این اے کی ترکیب کے لیے ریورس ٹرانسکرپٹیس کی صلاحیت سے محدود ہے، خاص طور پر جب بڑے سی ڈی این اے کی کلوننگ کی جاتی ہے۔MMLV کے مقابلے میں، SuperScripⅡ نے طویل RT-PCR مصنوعات کی پیداوار میں نمایاں اضافہ کیا۔RNaseH-reverse transscriptase نے بھی تھرموسٹیبلٹی میں اضافہ کیا ہے، لہذا رد عمل عام 37-42°C سے زیادہ درجہ حرارت پر انجام دیا جا سکتا ہے۔تجویز کردہ ترکیب کی شرائط کے تحت، oligo(dT) پرائمر اور [α-P]dCTP کا 10 μCi استعمال کریں۔پہلے اسٹرینڈ کی کل پیداوار کا حساب TCA ورن کا طریقہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔مکمل لمبائی والے سی ڈی این اے کا تجزیہ سائز کے مطابق ترتیب والے بینڈز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا اور اسے الکلائن ایگروز جیل پر شمار کیا گیا۔

3. ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے انکیوبیشن کا درجہ حرارت بڑھائیں:

انکیوبیشن کا زیادہ درجہ حرارت RNA کے ثانوی ڈھانچے کو کھولنے میں مدد کرتا ہے، جس سے ردعمل کی پیداوار میں اضافہ ہوتا ہے۔زیادہ تر آر این اے ٹیمپلیٹس کے لیے، بفر یا نمک کے بغیر RNA اور پرائمر کو 65°C پر انکیوبیٹ کرنا، اس کے بعد برف پر تیزی سے ٹھنڈا ہونا زیادہ تر ثانوی ڈھانچے کو ختم کر دے گا اور پرائمر کو باندھنے کی اجازت دے گا۔تاہم، کچھ ٹیمپلیٹس میں اب بھی ثانوی ڈھانچے ہوتے ہیں، یہاں تک کہ گرمی کی کمی کے بعد بھی۔تھرمو اسکرپٹ ریورس ٹرانسکرپٹس کا استعمال کرتے ہوئے ان مشکل ٹیمپلیٹس کی ایمپلیفیکیشن کی جا سکتی ہے اور امپلیفیکیشن کو بہتر بنانے کے لیے ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن کو زیادہ درجہ حرارت پر رکھ کر کیا جا سکتا ہے۔اعلی انکیوبیشن درجہ حرارت بھی مخصوصیت کو بڑھا سکتا ہے، خاص طور پر جب جین کے مخصوص پرائمر (GSP) کو cDNA کی ترکیب کے لیے استعمال کیا جاتا ہے (باب 3 دیکھیں)۔اگر GSP استعمال کر رہے ہیں، تو یقینی بنائیں کہ پرائمر کا Tm متوقع انکیوبیشن درجہ حرارت کے برابر ہے۔اولیگو(dT) اور 60°C سے اوپر کے بے ترتیب پرائمر استعمال نہ کریں۔رینڈم پرائمر کو 60 ڈگری سینٹی گریڈ تک بڑھنے سے پہلے 25 ° C پر 10 منٹ تک انکیوبیشن کی ضرورت ہوتی ہے۔زیادہ ریورس ٹرانسکرپشن ٹمپریچر استعمال کرنے کے علاوہ، RNA/primer مکس کو 65°C ڈینیچریشن ٹمپریچر سے ریورس ٹرانسکرپشن انکیوبیشن ٹمپریچر میں براہ راست منتقل کر کے اور پری وارمڈ 2× ری ایکشن مکسچر (cDNA ہاٹ سٹارٹ سنتھیسز) شامل کر کے بھی مخصوصیت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔یہ نقطہ نظر انٹرمولیکولر بیس جوڑی کو روکنے میں مدد کرتا ہے جو کم درجہ حرارت پر ہوتا ہے۔RT-PCR کے لیے درکار متعدد درجہ حرارت کی تبدیلی کو تھرمل سائیکلر کے ذریعے آسان بنایا جا سکتا ہے۔

Tth تھرموسٹیبل پولیمریز Mg2+ کی موجودگی میں DNA پولیمریز اور Mn2+ کی موجودگی میں RNA پولیمریز کے طور پر کام کرتا ہے۔اسے 65 ° C کے زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت پر گرم رکھا جا سکتا ہے۔تاہم، PCR کے دوران Mn2+ کی موجودگی وفاداری کو کم کرتی ہے، جو Tth پولیمریز کو اعلیٰ درستگی کے لیے کم موزوں بناتی ہے، جیسے cDNA کی کلوننگ۔اس کے علاوہ، Tth میں ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی کم ہے، جو حساسیت کو کم کرتی ہے، اور چونکہ ریورس ٹرانسکرپشن اور PCR کو ایک ہی انزائم کے ساتھ انجام دیا جا سکتا ہے، اس لیے ریورس ٹرانسکرپشن کے بغیر کنٹرول ری ایکشنز کو cDNA ایمپلیفیکیشن مصنوعات کا جینومک DNA کو آلودہ کرنے کے ساتھ موازنہ کرنے کے لیے استعمال نہیں کیا جا سکتا۔پرورش کی مصنوعات کو الگ کر دیا گیا تھا.

4. اضافی نقل جو ریورس ٹرانسکرپشن کو فروغ دیتے ہیں:

گلیسرول اور ڈی ایم ایس او سمیت اضافی اجزاء کو پہلے اسٹرینڈ کی ترکیب کے رد عمل میں شامل کیا جاتا ہے، جو نیوکلک ایسڈ ڈبل اسٹرینڈ کے استحکام کو کم کرسکتا ہے اور آر این اے کے ثانوی ڈھانچے کو کھول سکتا ہے۔SuperScript II یا MMLV سرگرمی کو متاثر کیے بغیر 20% گلیسرول یا 10% DMSO شامل کیا جا سکتا ہے۔AMV بغیر کسی سرگرمی کے 20% گلیسرول کو بھی برداشت کر سکتا ہے۔SuperScriptⅡ ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن میں RT-PCR کی حساسیت کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے، 10% گلیسرول شامل کیا جا سکتا ہے اور 45°C پر انکیوبیٹ کیا جا سکتا ہے۔اگر ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن پروڈکٹ کا 1/10 پی سی آر میں شامل کیا جاتا ہے، تو ایمپلیفیکیشن ری ایکشن میں گلیسرول کا ارتکاز 0.4% ہے، جو پی سی آر کو روکنے کے لیے کافی نہیں ہے۔

5. RNaseH علاج:

PCR سے پہلے RNaseH کے ساتھ cDNA ترکیب کے رد عمل کا علاج حساسیت کو بڑھا سکتا ہے۔کچھ ٹیمپلیٹس کے لیے، یہ خیال کیا جاتا ہے کہ سی ڈی این اے کی ترکیب کے رد عمل میں آر این اے ایمپلیفیکیشن مصنوعات کے پابند ہونے سے روکتا ہے، ایسی صورت میں RNaseH علاج حساسیت کو بڑھا سکتا ہے۔عام طور پر، RNaseH علاج ضروری ہوتا ہے جب لمبے لمبے سی ڈی این اے ٹارگٹ ٹیمپلیٹس کو بڑھایا جاتا ہے، جیسے کہ کم کاپی ٹیوبیرس شیروسیس II۔اس مشکل ٹیمپلیٹ کے لیے، RNaseH علاج نے SuperScript II یا AMV-synthesized cDNA کے ذریعہ تیار کردہ سگنل کو بڑھایا۔زیادہ تر RT-PCR رد عمل کے لیے، RNaseH علاج اختیاری ہے، کیونکہ 95°C پر PCR ڈینیچریشن مرحلہ عام طور پر RNA:DNA کمپلیکس میں RNA کو ہائیڈولائز کرتا ہے۔

6. چھوٹے آر این اے کا پتہ لگانے کے طریقہ کار میں بہتری:

RT-PCR خاص طور پر اس وقت مشکل ہوتا ہے جب صرف تھوڑی مقدار میں RNA دستیاب ہو۔RNA تنہائی کے دوران ایک کیریئر کے طور پر شامل Glycogen چھوٹے نمونوں کی پیداوار بڑھانے میں مدد کرتا ہے۔RNase فری گلائکوجن کو ایک ہی وقت میں شامل کیا جا سکتا ہے جس طرح Trizol کو شامل کیا جاتا ہے۔گلائکوجن پانی میں گھلنشیل ہے اور اسے آر این اے کے ساتھ پانی کے مرحلے میں رکھا جا سکتا ہے تاکہ بعد میں ہونے والی بارش میں مدد مل سکے۔50 ملی گرام سے کم ٹشو یا 106 کلچرڈ سیلز کے لیے، RNase فری گلائکوجن کی تجویز کردہ ارتکاز 250 μg/ml ہے۔

SuperScript II کا استعمال کرتے ہوئے ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن میں acetylated BSA کو شامل کرنے سے حساسیت میں اضافہ ہو سکتا ہے، اور RNA کی تھوڑی مقدار کے لیے، SuperScript II کی مقدار کو کم کرنے اور RNaseOut نیوکلیز انحیبیٹر کے 40 یونٹس کو شامل کرنے سے پتہ لگانے کی سطح میں اضافہ ہو سکتا ہے۔اگر RNA الگ تھلگ کرنے کے عمل میں گلائکوجن کا استعمال کیا جاتا ہے، تب بھی یہ سفارش کی جاتی ہے کہ سپر اسکرپٹ II کو ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن کے لیے استعمال کرتے وقت BSA یا RNase inhibitor شامل کریں۔

二、RT-PCR کی خصوصیت میں اضافہ کریں۔

1. CND ترکیب:

فرسٹ اسٹرینڈ سی ڈی این اے کی ترکیب کو تین مختلف طریقوں سے شروع کیا جا سکتا ہے، جس کی متعلقہ خصوصیت سی ڈی این اے کی ترکیب کی مقدار اور قسم کو متاثر کرتی ہے۔

بے ترتیب پرائمر طریقہ تین طریقوں میں سے کم سے کم مخصوص تھا۔پرائمر پورے ٹرانسکرپٹ میں متعدد سائٹس پر اینیل کرتے ہیں، مختصر، جزوی لمبائی والے سی ڈی این اے تیار کرتے ہیں۔یہ طریقہ اکثر 5′ اختتامی سلسلے حاصل کرنے اور RNA ٹیمپلیٹس سے ثانوی ڈھانچے کے علاقوں یا ختم کرنے والی سائٹس کے ساتھ cDNA حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے جنہیں ریورس ٹرانسکرپٹیس کے ذریعے نقل نہیں کیا جا سکتا۔سب سے لمبا سی ڈی این اے حاصل کرنے کے لیے، ہر آر این اے نمونے میں پرائمر اور آر این اے کا تناسب تجرباتی طور پر طے کرنے کی ضرورت ہے۔بے ترتیب پرائمر کا ابتدائی ارتکاز 50 سے 250 این جی فی 20 μl رد عمل کے درمیان تھا۔چونکہ بے ترتیب پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے کل RNA سے ترکیب شدہ cDNA بنیادی طور پر رائبوسومل RNA ہے، پولی(A)+RNA کو عام طور پر ٹیمپلیٹ کے طور پر منتخب کیا جاتا ہے۔

اولیگو (ڈی ٹی) پرائمر بے ترتیب پرائمر سے زیادہ مخصوص ہیں۔یہ زیادہ تر یوکرائیوٹک mRNAs کے 3′ سرے پر پائی جانے والی پولی (A) دم کو ہائبرڈائز کرتا ہے۔چونکہ پولی(A)+ RNA کل RNA کا تقریباً 1% تا 2% ہے، cDNA کی مقدار اور پیچیدگی بے ترتیب پرائمر کے مقابلے میں بہت کم ہے۔اس کی اعلی خصوصیت کی وجہ سے، oligo(dT) کو عام طور پر RNA کے تناسب کو پرائمر اور پولی(A)+ کے انتخاب کی اصلاح کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔0.5μg oligo(dT) فی 20μl ری ایکشن سسٹم استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔oligo(dT)12-18 زیادہ تر RT-PCR کے لیے موزوں ہے۔ThermoScript RT-PCR سسٹم اولیگو(dT)20 پیش کرتا ہے کیونکہ اس کے انکیوبیشن درجہ حرارت کے لیے بہتر تھرمل استحکام ہے۔

جین مخصوص پرائمر (GSP) ریورس ٹرانسکرپشن قدم کے لیے سب سے مخصوص پرائمر ہیں۔جی ایس پی ایک اینٹی سینس اولیگونوکلیوٹائڈ ہے جو خاص طور پر آر این اے کے ہدف کی ترتیب کو ہائبرڈائز کر سکتا ہے، بے ترتیب پرائمر یا اولیگو (ڈی ٹی) کے برعکس، جو تمام آر این اے کو اینیل کرتا ہے۔PCR پرائمر کو ڈیزائن کرنے کے لیے استعمال ہونے والے وہی اصول جو ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشنز میں GSP کے ڈیزائن پر لاگو ہوتے ہیں۔GSP ایمپلیفیکیشن پرائمر کی طرح ہی ترتیب ہو سکتا ہے جو mRNA کے 3′-سب سے زیادہ سرے سے منسلک ہوتا ہے، یا GSP کو ریورس ایمپلیفیکیشن پرائمر کے بہاو کو اینیل کرنے کے لیے ڈیزائن کیا جا سکتا ہے۔کچھ وسیع مضامین کے لیے، کامیاب RT-PCR کے لیے ایک سے زیادہ اینٹی سینس پرائمر ڈیزائن کرنے کی ضرورت ہے کیونکہ ہدف RNA کی ثانوی ساخت پرائمر بائنڈنگ کو روک سکتی ہے۔20 μl فرسٹ اسٹرینڈ ترکیب کے رد عمل میں 1 pmol antisense GSP استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

2. ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے انکیوبیشن کا درجہ حرارت بڑھائیں:

جی ایس پی کی خصوصیت سے بھرپور فائدہ اٹھانے کے لیے، زیادہ ترموسٹیبلٹی کے ساتھ ریورس ٹرانسکرپٹیس استعمال کیا جانا چاہیے۔رد عمل کی سختی کو بڑھانے کے لیے تھرموسٹیبل ریورس ٹرانسکرپٹیس کو زیادہ درجہ حرارت پر انکیوبیٹ کیا جا سکتا ہے۔مثال کے طور پر، اگر ایک GSP 55°C پر ختم ہو جاتا ہے، تو GSP کی خصوصیت پوری طرح سے استعمال نہیں ہو گی اگر AMV یا M-MLV کو 37°C کی کم سختی پر ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔تاہم، SuperScript II اور ThermoScript کا رد عمل 50°C یا اس سے زیادہ پر کیا جا سکتا ہے، جو کم درجہ حرارت پر پیدا ہونے والی غیر مخصوص مصنوعات کو ختم کر دے گا۔زیادہ سے زیادہ مخصوصیت کے لیے، RNA/primer مکس کو 65°C ڈینیچریشن ٹمپریچر سے براہ راست ریورس ٹرانسکرپشن انکیوبیشن ٹمپریچر میں منتقل کیا جا سکتا ہے اور پری وارمڈ 2× ری ایکشن مکس (cDNA سنتھیسس ہاٹ اسٹارٹ) میں شامل کیا جا سکتا ہے۔یہ کم درجہ حرارت پر انٹرمولیکولر بیس جوڑی کو روکنے میں مدد کرتا ہے۔RT-PCR کے لیے درکار متعدد درجہ حرارت کی منتقلی کو تھرمل سائیکلر کے ذریعے آسان بنایا جا سکتا ہے۔

3. جینومک ڈی این اے آلودگی کو کم کرتا ہے:

RT-PCR کے ساتھ پیش آنے والی ایک ممکنہ مشکل آر این اے میں جینومک ڈی این اے کی آلودگی ہے۔آر این اے کو الگ کرنے کا ایک اچھا طریقہ استعمال کرنا، جیسے ٹرائزول ریجنٹ، آر این اے کی تیاری کو آلودہ کرنے والے جینومک ڈی این اے کی مقدار کو کم کر دے گا۔جینومک ڈی این اے سے اخذ کردہ مصنوعات سے بچنے کے لیے، ریورس ٹرانسکرپشن سے پہلے آلودہ ڈی این اے کو ہٹانے کے لیے آر این اے کا علاج ایمپلیفیکیشن گریڈ ڈی نیس I سے کیا جا سکتا ہے۔DNase I کے عمل انہضام کو 65 ° C پر 10 منٹ کے لئے 2.0 mM EDTA میں نمونے لگا کر ختم کر دیا گیا۔EDTA میگنیشیم آئنوں کو چیلیٹ کر سکتا ہے، اعلی درجہ حرارت پر میگنیشیم آئن پر منحصر RNA ہائیڈرولیسس کو روک سکتا ہے۔

ایمپلیفائیڈ سی ڈی این اے کو جینومک ڈی این اے ایمپلیفیکیشن پروڈکٹس کو آلودہ کرنے سے الگ کرنے کے لیے، پرائمر ایسے ڈیزائن کیے جا سکتے ہیں کہ ہر ایک اینیل ایکسون کو الگ کرے۔سی ڈی این اے سے حاصل کردہ پی سی آر پروڈکٹس آلودہ جینومک ڈی این اے سے حاصل کردہ مصنوعات سے کم ہوں گی۔اس کے علاوہ، ہر آر این اے ٹیمپلیٹ پر ریورس ٹرانسکرپشن کے بغیر ایک کنٹرول تجربہ کیا گیا تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا کوئی ٹکڑا جینومک ڈی این اے یا سی ڈی این اے سے اخذ کیا گیا ہے۔ریورس ٹرانسکرپشن کے بغیر حاصل کردہ پی سی آر پروڈکٹ جینوم سے ماخوذ ہے۔