پی سی آر مشین|کیا آپ واقعی سمجھتے ہیں؟

نوبل انعام یافتہ PCR ٹیکنالوجی

1993 میں، امریکی سائنسدان مولیس کو کیمسٹری کا نوبل انعام ملا، اور ان کا کارنامہ پی سی آر ٹیکنالوجی کی ایجاد تھا۔پی سی آر ٹیکنالوجی کا جادو درج ذیل خصوصیات میں ہے: سب سے پہلے، ڈی این اے کی مقدار کو بڑھانا بہت کم ہے، اور نظریاتی طور پر ایک مالیکیول کو بڑھاوا دینے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔دوم، امپلیفیکیشن کی کارکردگی زیادہ ہے، اور ہدف جین کی مقدار ایکسپونینشل ہے۔ایمپلیفیکیشن، چند گھنٹوں میں 10 ملین سے زیادہ بار۔اب پی سی آر آلے کو لائف سائنس ریسرچ اور بہت سے دوسرے پہلوؤں میں بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے۔

تھرمل سائیکلرز کے مختلف ماڈلز اور مینوفیکچررز مختلف کارکردگی اور دہرانے کی صلاحیت کا مظاہرہ کر سکتے ہیں۔یہ اختلافات نہ صرف پی سی آر کی کارکردگی کو متاثر کرتے ہیں بلکہ حاصل کردہ ڈیٹا کی درستگی اور مستقل مزاجی کو بھی متاثر کرتے ہیں۔پی سی آر مشین کی خصوصیات کو سمجھنے سے ہمیں اپنے تجربات کی کامیابی کو زیادہ سے زیادہ کرنے میں مدد مل سکتی ہے۔

حرارتی ماڈیول

تھرمل سائیکلر کے درجہ حرارت کی درستگی پی سی آر کی کامیابی یا ناکامی کے لیے فیصلہ کن ثابت ہو سکتی ہے۔قابل اعتماد اور قابل تولید PCR نتائج حاصل کرنے کے لیے حرارتی بلاک پر اچھی طرح سے درجہ حرارت کی مستقل مزاجی بھی اہم ہے۔

تھرمل درستگی کو یقینی بنانے کا ایک طریقہ یہ ہے کہ درجہ حرارت کی تصدیق کرنے والی کٹس کا استعمال کرتے ہوئے کثرت سے ٹیسٹ کریں اور تربیت یافتہ پیشہ ور کے ذریعہ ضرورت کے مطابق دوبارہ ترتیب دیں۔درجہ حرارت کی تصدیق کے ٹیسٹ عام طور پر استعمال ہوتے ہیں:

isothermal موڈ میں درجہ حرارت سیٹ کرنے کی نسبت اچھی طرح سے درستگی

درجہ حرارت کی تبدیلی کے بعد درجہ حرارت سیٹ کرنے کے لیے اچھی طرح سے درستگی

گرمی کے ڈھکن کے درجہ حرارت کی درستگی

پرائمر اینیلنگ ٹمپریچر کنٹرول

گریڈینٹ ٹمپریچر کنٹرول پی سی آر انسٹرومنٹ کا ایک فنکشن ہے جو پی سی آر میں پرائمر اینیلنگ کو بہتر بنانے میں سہولت فراہم کرتا ہے۔تدریجی ترتیب کا مقصد ماڈیولز کے درمیان مختلف درجہ حرارت کو حاصل کرنا ہے، اور ہر کالم کے درمیان ≥2°C درجہ حرارت میں اضافے اور گرنے سے، بہترین پرائمر اینیلنگ درجہ حرارت حاصل کرنے کے لیے مختلف درجہ حرارت کو بیک وقت جانچا جا سکتا ہے۔نظریاتی طور پر، ایک حقیقی میلان ماڈیولز کے درمیان لکیری درجہ حرارت حاصل کرتا ہے۔

تاہم، روایتی تدریجی تھرمل سائیکلرز عام طور پر دونوں سروں پر واقع دو حرارتی اور کولنگ عناصر کے ذریعے ایک ہی تھرمل بلاک اور کنٹرول درجہ حرارت کو استعمال کرتے ہیں، جس کے نتیجے میں اکثر درج ذیل حدود ہوتی ہیں:

صرف دو درجہ حرارت سیٹ کیے جا سکتے ہیں: پرائمر اینیلنگ کے لیے اعلی اور کم درجہ حرارت تھرمل ماڈیول کے دونوں سروں پر سیٹ کیے جاتے ہیں، اور ماڈیول کے درمیان دوسرے درجہ حرارت کی قطعی ترتیب حاصل نہیں کی جا سکتی۔

مختلف کالموں کے درمیان حرارت کے تبادلے کی وجہ سے، ماڈیول پر مختلف خطوں کے درمیان درجہ حرارت کا حقیقی لکیری میلان کی بجائے سگمائیڈل وکر کی پیروی کرنے کا زیادہ امکان ہوتا ہے۔

نمونہ درجہ حرارت

پی سی آر کے نتائج کی درستگی کے لیے نمونے کے درجہ حرارت کو کنٹرول کرنے کے لیے تھرمل سائیکلر کی صلاحیت بہت اہم ہے۔آلے کے لیے مخصوص پیرامیٹرز جیسے کہ ریمپ کی شرح، ہولڈ ٹائم، اور الگورتھم نمونے کے درجہ حرارت کی پیش گوئی کے لیے اہم ہیں۔

پی سی آر مشین کی حرارت اور ٹھنڈک کی شرح کا مطلب یہ ہے کہ پی سی آر کے مراحل کے درمیان درجہ حرارت میں تبدیلی جو ایک خاص مدت میں ہوتی ہے۔چونکہ گرمی کو ماڈیول سے نمونے میں منتقل کرنے میں ایک خاص وقت لگتا ہے، اس لیے نمونے کی اصل حرارت اور ٹھنڈک کی شرح سست ہوگی۔لہذا، درجہ حرارت کی تبدیلی کی رفتار کی تعریف کو الگ کرنے اور سمجھنے کی ضرورت ہے.

زیادہ سے زیادہ یا چوٹی ماڈیول ریمپ کی شرح درجہ حرارت کی تیز ترین تبدیلی کی نمائندگی کرتی ہے جو ماڈیول ریمپ کے دوران بہت کم وقت میں حاصل کر سکتا ہے۔

اوسط بلاک ریمپ کی شرح ایک طویل عرصے کے دوران درجہ حرارت کی تبدیلی کی شرح کو ظاہر کرتی ہے اور PCR مشین کی رفتار کا زیادہ نمائندہ پیمائش فراہم کرے گی۔

زیادہ سے زیادہ نمونہ حرارتی اور کولنگ کی شرح اور اوسط نمونہ حرارتی اور کولنگ کی شرح نمونے کے ذریعہ حاصل کردہ اصل درجہ حرارت کی عکاسی کرتی ہے۔نمونہ حرارتی اور کولنگ کی شرح PCR مشین کی کارکردگی اور PCR کے نتائج پر اس کے ممکنہ اثرات کا زیادہ درست موازنہ فراہم کرے گی۔

سائیکلر کو تبدیل کرتے وقت، ریمپ ریٹ پروگرام کے ساتھ ایک ایسا آلہ استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے جو آسانی سے تبدیلی اور PCR کی تکرار پذیری پر کم سے کم اثر کے لیے پچھلے موڈ کی نقالی کرے۔

تھرمل سائکلر کو نمونہ کے مقررہ درجہ حرارت تک پہنچنے کے بعد ہی وقت کے مراحل کے لیے ڈیزائن کیا جانا چاہیے۔اس طرح، مقررہ درجہ حرارت پر نمونے کو برقرار رکھنے کا وقت آپریٹنگ طریقہ کار میں درکار سائیکل کی متعلقہ شرائط کے ساتھ زیادہ درست طریقے سے برقرار رہے گا۔

تھرمل سائیکلرز اکثر پیچیدہ ریاضیاتی الگورتھم استعمال کرتے ہیں تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ نمونے پہلے سے طے شدہ پروگرام کے مطابق ایک مقررہ درجہ حرارت تک تیزی سے پہنچ سکتے ہیں۔رد عمل کے نظام کے حجم اور استعمال شدہ پی سی آر پلاسٹک کی موٹائی کی بنیاد پر، الگورتھم نمونے کے درجہ حرارت اور مقررہ درجہ حرارت تک پہنچنے میں لگنے والے وقت کا اندازہ لگا سکتا ہے۔ان الگورتھم پر انحصار کرتے ہوئے، تھرمل سائکلر کے حرارتی یا کولنگ کے عمل کے دوران، بلاک کا درجہ حرارت عام طور پر تھرمل بلاک اوور شوٹ یا انڈر شوٹ نامی عمل کے ذریعے مقررہ قدر سے تجاوز کر جائے گا۔اس طرح کا سیٹ اپ اس بات کو یقینی بناتا ہے کہ نمونہ خود کو اوور شوٹنگ یا انڈر شوٹنگ کے بغیر جتنی جلدی ممکن ہو مقررہ درجہ حرارت تک پہنچ جائے۔

تجرباتی تھرو پٹ

تھرمل سائیکلر کے تھرو پٹ میں اضافہ کرنے والے عوامل میں ریمپ ریٹ، تھرمل بلاک کنفیگریشن، اور آٹومیشن پلیٹ فارمز کا انضمام شامل ہیں۔

تھرمل سائیکلر کی حرارت اور کولنگ کی شرح اس رفتار کی نمائندگی کرتی ہے جس سے یہ مقررہ درجہ حرارت تک پہنچتا ہے۔درجہ حرارت میں جتنی تیزی سے اضافہ اور کمی ہوگی، پی سی آر اتنی ہی تیزی سے چلے گا، جس کا مطلب ہے کہ مقررہ مدت میں مزید تجربات مکمل کیے جاسکتے ہیں۔مزید برآں، تیز رفتار ڈی این اے پولیمریز کا استعمال کرکے تجربات کو تیز کیا جا سکتا ہے۔

پی سی آر تجربات کے لیے تھرمل سائیکلر ماڈیول کا ڈیزائن بھی اہم ہے۔مثال کے طور پر، بدلنے کے قابل ماڈیول فی رن نمونوں کی تعداد میں لچک کی اجازت دیتے ہیں۔اس کے علاوہ، انفرادی طور پر قابل کنٹرول ماڈیولز کے ساتھ حرارتی ماڈیول ایک تھرمل سائیکلر پر بیک وقت مختلف پی سی آر پروگرام چلانے کے لیے مثالی ہیں۔

خودکار ہائی تھرو پٹ PCR کے لیے، سافٹ ویئر جو پائپٹنگ ہینڈلنگ سسٹم کو کنٹرول کرتا ہے وہ قابل پروگرام اور مطابقت پذیر ہونا چاہیے۔خودکار نظام اعلی تھرو پٹ پی سی آر رد عمل انجام دینے کے لیے مثالی ہیں کیونکہ انہیں تھوڑی انسانی مداخلت کے ساتھ مسلسل چلایا جا سکتا ہے، اس طرح دستی تجرباتی سیٹ اپ کے لیے درکار وقت کو کم سے کم کیا جاتا ہے اور ایک مقررہ مدت میں رد عمل کی تعداد میں اضافہ ہوتا ہے۔

تھرمل سائیکلرز کی وشوسنییتا، پائیداری اور کوالٹی اشورینس

کارکردگی اور تھرو پٹ صلاحیتوں کے علاوہ، پی سی آر مشین کو بعض بار بار استعمال، ماحولیاتی دباؤ، اور شپنگ کے حالات کو بھی برداشت کرنے کے قابل ہونا چاہیے۔کچھ مینوفیکچررز اس بات کی اطلاع دے سکتے ہیں کہ آلہ کس طرح وشوسنییتا اور پائیداری کے ٹیسٹ کرتا ہے۔متعلقہ پی سی آر آلے کا پتہ لگانے میں شامل ہیں:

وشوسنییتا: مکینیکل رگوں کو بار بار استعمال ہونے والے آلات کے اجزاء جیسے تھرمل ڈھکن، کنٹرول پینل/ٹچ اسکرین، اور درجہ حرارت سائیکلنگ ماڈیولز پر بار بار ٹیسٹ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔

محیطی دباؤ: ماحولیاتی چیمبرز کو معمول کے تجربات کی مختلف حالتوں کی تقلید کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جیسے درجہ حرارت، نمی۔

شپنگ ٹیسٹنگ: شدید جھٹکا اور وائبریشن ٹیسٹنگ بین الاقوامی سیفٹی شپنگ ایسوسی ایشن کے معیارات کے مطابق کی جا سکتی ہے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ آلہ بغیر کسی نقصان کے آپریٹنگ حالات میں پہنچ سکتا ہے۔

پی سی آر مشین کو برقرار رکھنے کے لیے وارنٹی اور سروس

سخت وشوسنییتا اور پائیداری کی جانچ کے باوجود، تھرمل سائیکلرز کو لازمی طور پر آلے کی زندگی پر تکنیکی مسائل کا سامنا کرنا پڑتا ہے۔ذہنی سکون کے لیے، آلہ خریدتے وقت مینوفیکچرر کی وارنٹی، سروس اور دیکھ بھال پر غور کیا جانا چاہیے۔

کام کی کارکردگی پر پڑنے والے اثرات کو کم کرنے کے لیے خدمات کی لچک جیسے کہ سائٹ پر/فیکٹری سے واپسی کی دیکھ بھال، ریموٹ مانیٹرنگ سروسز، اور بحالی کے عمل میں متبادل آلات وغیرہ۔

وارنٹی مدت کی طوالت، سروس کے بدلنے کا وقت، تکنیکی مدد کی رسائی، اور پیشہ ورانہ معاون اہلکاروں کی مہارت۔

لیبارٹری اور متعلقہ ریگولیٹری ضروریات کو پورا کرنے کے لیے آلات کی تنصیب، آپریشن، تعاون، اور تصدیق کی فزیبلٹی۔دیکھ بھال کی خدمات جیسے درجہ حرارت کی تصدیق، جانچ، اور انشانکن اس بات کو یقینی بنانے کے لیے دستیاب ہیں کہ آلہ متعلقہ پیرامیٹرز کے ساتھ مناسب طریقے سے کارکردگی کا مظاہرہ کرتا ہے۔

متعلقہ مصنوعات: