Ct قدر فلوروسینٹ مقداری PCR کی سب سے اہم نتیجہ پیش کرنے کی شکل ہے۔یہ جین کے اظہار کے فرق یا جین کاپی نمبر کا حساب لگانے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔تو فلوروسینس کوانٹیفیکیشن کی Ct قدر کو کیا معقول سمجھا جاتا ہے؟Ct قدر کی مؤثر حد کو کیسے یقینی بنایا جائے؟

سی ٹی ویلیو کیا ہے؟
qPCR ایمپلیفیکیشن کے عمل کے دوران، ایمپلیفیکیشن سائیکلوں کی متعلقہ تعداد (سائیکل تھریشولڈ) جب ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کا فلوروسینس سگنل سیٹ فلوروسینس تھریشولڈ تک پہنچ جاتا ہے۔C کا مطلب ہے سائیکل اور T کا مطلب تھریشولڈ ہے۔سیدھے الفاظ میں، Ct قدر سائیکلوں کی تعداد ہے جو اس کے مطابق ہے جب ابتدائی ٹیمپلیٹ ایمپلیفیکیشن qPCR میں مصنوعات کی ایک خاص مقدار تک پہنچ جاتی ہے۔نام نہاد "مصنوعات کی ایک خاص مقدار" کی مزید وضاحت بعد میں کی جائے گی۔

Ct قدر کیا کرتی ہے؟

1. ایکسپونینشل ایمپلیفیکیشن، ٹیمپلیٹ کی رقم اور Ct قدر کے درمیان تعلق
مثالی طور پر، کیو پی سی آر میں جین ایک مخصوص تعداد کے چکروں کے بعد ایکسپونیشنل ایمپلیفیکیشن کے ذریعے جمع ہوتے ہیں۔ایمپلیفیکیشن سائیکلوں کی تعداد اور مصنوعات کی مقدار کے درمیان تعلق یہ ہے: امپلیفائیڈ پروڈکٹ کی رقم = ابتدائی ٹیمپلیٹ رقم × (1+En) سائیکل نمبر۔تاہم، کیو پی سی آر کا رد عمل ہمیشہ مثالی صورت حال میں نہیں ہوتا ہے۔جب امپلیفائیڈ پروڈکٹ کی مقدار "مخصوص پروڈکٹ کی رقم" تک پہنچ جاتی ہے، تو اس وقت سائیکلوں کی تعداد Ct قدر ہوتی ہے، اور یہ ایکسپونینشل ایمپلیفیکیشن کی مدت میں ہوتی ہے۔Ct قدر اور ابتدائی ٹیمپلیٹ کی مقدار کے درمیان تعلق: ٹیمپلیٹ کی Ct قدر اور ٹیمپلیٹ کے ابتدائی کاپی نمبر کے لوگارتھم کے درمیان ایک خطی تعلق ہے۔ابتدائی ٹیمپلیٹ کا ارتکاز جتنا زیادہ ہوگا، Ct قدر اتنی ہی کم ہوگی۔ابتدائی ٹیمپلیٹ کا ارتکاز جتنا کم ہوگا، Ct قدر اتنی ہی زیادہ ہوگی۔

2. ایمپلیفیکیشن وکر، فلوروسینس تھریشولڈ اور مخصوص پی سی آر پروڈکٹ کی رقم
کیو پی سی آر ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ کی مقدار براہ راست فلوروسینٹ سگنل کی شکل میں پیش کی جاتی ہے، یعنی ایمپلیفیکیشن وکر۔پی سی آر کے ابتدائی مرحلے میں، امپلیفیکیشن مثالی حالات میں ہے، سائیکلوں کی تعداد کم ہے، مصنوعات کی جمع چھوٹی ہے، اور فلوروسینس کی سطح کو فلوروسینس کے پس منظر سے واضح طور پر ممتاز نہیں کیا جا سکتا ہے۔اس کے بعد، فلوروسینس بڑھتا ہے اور ایکسپونینشنل مرحلے میں داخل ہوتا ہے۔پی سی آر پروڈکٹ کی مقدار کا پتہ کسی خاص موڑ پر اس وقت لگایا جا سکتا ہے جب پی سی آر کا رد عمل صرف ایکسپونینشنل مرحلے میں ہو، جسے "مصنوع کی ایک خاص مقدار" کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے، اور اس سے ٹیمپلیٹ کے ابتدائی مواد کا اندازہ لگایا جا سکتا ہے۔لہذا، مصنوعات کی ایک خاص مقدار کے مطابق فلوروسینس سگنل کی شدت فلوروسینس کی حد ہے۔

پی سی آر کے آخری مرحلے میں، ایمپلیفیکیشن وکر اب ایکسپونیشنل ایمپلیفیکیشن نہیں دکھاتا ہے، اور لکیری مرحلے اور سطح مرتفع کے مرحلے میں داخل ہوتا ہے۔

3. Ct اقدار کی تولیدی صلاحیت
جب PCR سائیکل Ct ویلیو کے سائیکل نمبر تک پہنچ جاتا ہے، تو یہ ابھی حقیقی ایکسپونیشنل ایمپلیفیکیشن پیریڈ میں داخل ہوا ہے۔اس وقت، چھوٹی غلطی کو بڑھایا نہیں گیا ہے، لہذا Ct قدر کی تولیدی صلاحیت بہترین ہے، یعنی ایک ہی ٹیمپلیٹ کو مختلف اوقات میں یا ایک ہی وقت میں مختلف ٹیوبوں میں بڑھایا جاتا ہے۔ایمپلیفیکیشن، حاصل کردہ Ct قدر مستقل ہے۔

1. ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی En
پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی سے مراد وہ کارکردگی ہے جس کے ساتھ پولیمریز جین کو ایمپلیفیکیشن میں تبدیل کرتا ہے۔جب ایک ڈی این اے مالیکیول دو ڈی این اے مالیکیولز میں تبدیل ہوتا ہے تو ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی 100٪ ہے۔ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کو عام طور پر En کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔بعد کے مضامین کے تجزیے کو آسان بنانے کے لیے، ان عوامل کا مختصراً تعارف کرایا گیا ہے جو امپلیفیکیشن کی کارکردگی کو متاثر کرتے ہیں۔

2. Ct اقدار کی حد
Ct قدریں 15-35 تک ہوتی ہیں۔اگر Ct قدر 15 سے کم ہے، تو یہ سمجھا جاتا ہے کہ امپلیفیکیشن بیس لائن کی مدت کے اندر ہے اور فلوروسینس کی حد تک نہیں پہنچی ہے۔مثالی طور پر، Ct قدر اور ٹیمپلیٹ کے ابتدائی کاپی نمبر کے لوگارتھم کے درمیان ایک خطی تعلق ہے، یعنی معیاری وکر۔معیاری منحنی خطوط کے ذریعے، جب امپلیفیکیشن کی کارکردگی 100% ہوتی ہے، تو جین کے واحد کاپی نمبر کی مقدار درست کرنے کے لیے حسابی Ct قدر تقریباً 35 ہوتی ہے۔ اگر یہ 35 سے زیادہ ہے، تو ٹیمپلیٹ کا ابتدائی کاپی نمبر نظریاتی طور پر 1 سے کم ہے، جسے بے معنی سمجھا جا سکتا ہے۔

مختلف جین Ct رینجز کے لیے، ابتدائی ٹیمپلیٹ کی مقدار میں جین کاپی نمبر اور ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی میں فرق کی وجہ سے، یہ ضروری ہے کہ جین کے لیے ایک معیاری وکر بنایا جائے اور جین کی لکیری کھوج کی حد کا حساب لگایا جائے۔

3. Ct قدر کے عوامل کو متاثر کرنا
ایمپلیفیکیشن سائیکلوں کی تعداد اور پروڈکٹ کی مقدار کے درمیان تعلق سے: ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کی مقدار = ابتدائی ٹیمپلیٹ کی مقدار × (1+En) سائیکل نمبر، یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ مثالی حالات میں، ابتدائی ٹیمپلیٹ اور En کی مقدار Ct قدر پر منفی اثر ڈالے گی۔ٹیمپلیٹ کے معیار یا ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی میں فرق Ct قدر کو بہت بڑا یا بہت چھوٹا کرنے کا سبب بنے گا۔

4.Ct قدر بہت بڑی یا بہت چھوٹی ہے۔