پی سی آر ردعمل کی نمایاں خصوصیت اس کی بڑی امپلیفیکیشن صلاحیت اور انتہائی حساسیت ہے۔پی سی آر کی کارکردگی اور پتہ لگانے کی کارکردگی کو بہتر بنانے کے لیے، ہم پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی صلاحیت اور پتہ لگانے کی حساسیت کو بہتر بنانے کے لیے پرعزم ہیں، لیکن سر درد تجربے کے عمل میں ہے۔غلط مثبتات اکثر پائے جاتے ہیں، اور نمونے کی کراس آلودگی یا PCR مصنوعات کی آلودگی کی بہت کم مقدار تجربے میں غلط مثبتات کا سبب بن سکتی ہے۔
پی سی آر مصنوعات کی آلودگی کی پانچ اقسام
پی سی آر آلودگی کی بہت سی وجوہات ہیں، جنہیں تقریباً درج ذیل زمروں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔
نمونہ کی آلودگی بنیادی طور پر نمونہ جمع کرنے کے لیے کنٹینر کی آلودگی کی وجہ سے ہوتی ہے، یا جب نمونہ رکھا جاتا ہے تو یہ ڈھیلی سیلنگ کی وجہ سے کنٹینر سے باہر نکل جاتا ہے، یا نمونہ کنٹینر کے باہر چپک جاتا ہے، جس سے کراس آلودگی ہوتی ہے۔آلودگی نمونوں کے درمیان آلودگی کا باعث بنتی ہے۔کچھ مائکروبیل نمونے، خاص طور پر وائرس، ایروسول کے ساتھ پھیل سکتے ہیں یا ایروسول بن سکتے ہیں، جس کے نتیجے میں باہمی آلودگی ہوتی ہے۔
اس کی بنیادی وجہ یہ ہے کہ پی سی آر ری ایجنٹس کی تیاری کے دوران نمونہ گن، کنٹینر، ڈبل ڈسٹلڈ واٹر اور دیگر محلول پی سی آر نیوکلک ایسڈ ٹیمپلیٹ سے آلودہ ہوتے ہیں۔
مالیکیولر بائیولوجی لیبارٹریوں اور کچھ لیبارٹریوں میں جو کلون شدہ پلازمیڈ کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کرتی ہیں، کلون شدہ پلازمیڈ آلودگی کا مسئلہ بھی عام ہے۔کیونکہ یونٹ کے حجم میں کلوننگ پلاسمڈ کا مواد کافی زیادہ ہے، اور صاف کرنے کے عمل میں مزید ٹولز اور ریجنٹس کی ضرورت ہوتی ہے، اور زندہ خلیوں میں پلاسمڈ کے آلودہ ہونے کا امکان بہت زیادہ ہوتا ہے کیونکہ زندہ خلیوں کی مضبوط نشوونما اور تولیدی صلاحیت۔
پی سی آر کے رد عمل میں ایمپلیفائیڈ مصنوعات کی آلودگی سب سے عام آلودگی کا مسئلہ ہے۔چونکہ پی سی آر پروڈکٹ کی کاپی کی مقدار بڑی ہے (عام طور پر 1013 کاپیاں/ملی لیٹر)، جو کہ پی سی آر کا پتہ لگانے والی کاپی نمبر کی حد سے کہیں زیادہ ہے، اس لیے پی سی آر پروڈکٹ کی آلودگی کی بہت کم مقدار غلط مثبت کا سبب بن سکتی ہے۔
ایروسول آلودگی PCR مصنوعات کی آلودگی کی سب سے زیادہ ممکنہ شکل ہے، اور اسے نظر انداز کرنا بھی سب سے آسان ہے۔یہ مائع کی سطح اور ہوا کے درمیان رگڑ سے بنتا ہے۔عام طور پر، ایروسول کی آلودگی اس وقت بن سکتی ہے جب ڈھکنا کھولا جاتا ہے، جب نمونہ تیار کیا جاتا ہے، یا اس وقت بھی جب ری ایکشن ٹیوب کو زور سے ہلایا جاتا ہے۔حساب کے مطابق ایک ایروسول پارٹیکل میں 48000 کاپیاں ہوسکتی ہیں، اس لیے اس سے پیدا ہونے والی آلودگی ایک ایسا مسئلہ ہے جو خصوصی توجہ کا مستحق ہے۔
خاص طور پر، ٹیسٹنگ لیبارٹریز اکثر ایک مخصوص جین کو جانچنے کے لیے پرائمر کے ایک ہی جوڑے کا استعمال کرتی ہیں۔وقت گزرنے کے ساتھ، لیبارٹری کی جگہ میں PCR مصنوعات کی آلودگی کی ایک بڑی مقدار واقع ہوگی۔ایک بار جب ایسی آلودگی پھیل جائے تو اسے مختصر وقت میں ختم کرنا مشکل ہو جاتا ہے۔
آلودگی کی پہلی تین اقسام سے بچنے کے لیے ہم موثر ذرائع استعمال کر سکتے ہیں لیکن پی سی آر مصنوعات کی وجہ سے ہونے والی آلودگی کو روکنا مشکل ہے، خاص طور پر غیر معیاری پی سی آر لیبارٹریوں کی تعمیر میں۔پی سی آر کے عمل میں، جب پائپیٹ کی نوک مائع کو چوس کر اڑا دیتی ہے، اور پی سی آر ٹیوب کا احاطہ کھل جاتا ہے، ایک ایروسول بن جائے گا۔ایروسول کے ذریعے لے جانے والے ڈی این اے مالیکیول (ایک ایروسول دسیوں ہزار ڈی این اے لے سکتا ہے) کو ختم کرنا مشکل ہے کیونکہ وہ ہوا میں تیرتے ہیں۔ایک بار جب PCR تجربات کا اگلا دور متعارف کرایا جاتا ہے، غلط مثبت لامحالہ واقع ہوں گے۔
جیسا کہ ذیل کے اعداد و شمار میں دکھایا گیا ہے، منفی کنٹرول نے دلچسپی کے متعلقہ بینڈ کو بھی بڑھا دیا:
PCR آلودگی اور روک تھام کے اس شمارے کا پہلا حصہ یہاں پیش کیا گیا ہے۔اگلا شمارہ آپ کے لیے دوسرا حصہ "PCR مصنوعات کی آلودگی کی روک تھام" لے کر آئے گا، تو دیکھتے رہیں!
پوسٹ ٹائم: جولائی 25-2017
