• فیس بک
  • لنکڈ
  • یوٹیوب

ابتدائی مواد: آر این اے

مقداری ریورس ٹرانسکرپشن PCR (RT-qPCR) ایک تجرباتی طریقہ ہے جو PCR تجربات میں RNA کو ابتدائی مواد کے طور پر استعمال کرتے ہیں۔اس طریقہ کار میں، کل RNA یا میسنجر RNA (mRNA) کو پہلے معکوس ٹرانسکرپٹیس کے ذریعے تکمیلی DNA (cDNA) میں نقل کیا جاتا ہے۔اس کے بعد، سی ڈی این اے کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کرتے ہوئے کیو پی سی آر کا رد عمل کیا گیا۔RT-qPCR کو مختلف قسم کے مالیکیولر بائیولوجی ایپلی کیشنز میں استعمال کیا گیا ہے، جن میں جین ایکسپریشن تجزیہ، RNA مداخلت کی توثیق، مائیکرو رے کی توثیق، پیتھوجین کا پتہ لگانے، جینیاتی جانچ، اور بیماری کی تحقیق شامل ہیں۔

RT-qPCR کے لیے ایک قدم اور دو قدمی طریقے

RT-qPCR کو ایک قدم یا دو قدمی طریقہ سے مکمل کیا جا سکتا ہے۔ایک قدمی RT-qPCR ریورس ٹرانسکرپشن اور پی سی آر ایمپلیفیکیشن کو یکجا کرتا ہے، جس سے ریورس ٹرانسکرپٹیس اور ڈی این اے پولیمریز ایک ہی بفر حالات میں ایک ہی ٹیوب میں رد عمل کو مکمل کر سکتے ہیں۔ایک قدمی RT-qPCR کے لیے صرف ترتیب کے لیے مخصوص پرائمر کے استعمال کی ضرورت ہوتی ہے۔دو قدمی RT-qPCR میں، ریورس ٹرانسکرپشن اور PCR ایمپلیفیکیشن کو دو ٹیوبوں میں انجام دیا جاتا ہے، مختلف آپٹمائزڈ بفرز، ری ایکشن کنڈیشنز، اور پرائمر ڈیزائن کی حکمت عملیوں کا استعمال کرتے ہوئے۔

آرٹیکل 1

 

فائدہ

نقصان

ایک قدم اس طریقہ کار میں تجرباتی غلطی کم ہے کیونکہ دونوں رد عمل ایک ٹیوب میں ہوتے ہیں۔

 

پائپنگ کے کم اقدامات آلودگی کے خطرے کو کم کرتے ہیں۔

 

ہائی تھرو پٹ ایمپلیفیکیشن/اسکریننگ کے لیے موزوں، تیز اور دوبارہ پیدا کرنے کے قابل

دو قدمی ردعمل کو الگ سے بہتر نہیں کیا جا سکتا

 

چونکہ رد عمل کے حالات دو قدمی رد عمل کو ملا کر سمجھوتہ کیے جاتے ہیں، اس لیے حساسیت اتنی اچھی نہیں ہے جتنی دو قدمی طریقہ کی ہے۔

 

کسی ایک نمونے کے ذریعے پائے جانے والے اہداف کی تعداد کم ہے۔

دو قدم مستحکم سی ڈی این اے لائبریریاں بنانے کی اہلیت جو طویل عرصے تک ذخیرہ کی جا سکتی ہے اور متعدد رد عمل میں استعمال ہو سکتی ہے۔

 

متعدد سی ڈی این اے لائبریریوں کی ضرورت کے بغیر ٹارگٹ جینز اور ریفرنس جینز کو ایک ہی سی ڈی این اے لائبریری سے بڑھایا جا سکتا ہے۔

 

ری ایکشن بفرز اور ری ایکشن کنڈیشنز جو سنگل ری ایکشن رن کی اصلاح کو قابل بناتے ہیں۔

 

محرک حالات کا لچکدار انتخاب

متعدد ٹیوبوں کا استعمال، اور زیادہ پائپنگ کے اقدامات ڈی این اے کی آلودگی کا خطرہ بڑھاتا ہے،

اور وقت لگ رہا ہے.

 

ایک قدمی طریقہ سے زیادہ اصلاح کی ضرورت ہے۔

متعلقہ مصنوعات:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (ایک مرحلہ) -SYBR گرین I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-تقمان

RT Easyᴹ I Master Premix For First Strand CDNA Synthesis

ریئل ٹائم PCR Easyᵀᴹ-SYBR گرین I کٹ

ریئل ٹائم PCR Easyᵀᴹ- Taqman

کل RNA اور mRNA کا انتخاب

RT-qPCR کے تجربے کو ڈیزائن کرتے وقت، یہ فیصلہ کرنا ضروری ہے کہ آیا ٹوٹل RNA یا پیوریفائیڈ mRNA کو ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کرنا ہے۔اگرچہ mRNA قدرے زیادہ حساسیت فراہم کرنے کے قابل ہو سکتا ہے، کل RNA اب بھی کثرت سے استعمال ہوتا ہے۔اس کی وجہ یہ ہے کہ کل RNA کا mRNA کے مقابلے میں ابتدائی مواد کے طور پر زیادہ اہم فائدہ ہے۔سب سے پہلے، عمل کو صاف کرنے کے کم اقدامات کی ضرورت ہوتی ہے، جو ٹیمپلیٹ کی بہتر مقداری بحالی اور سیل نمبروں کو شروع کرنے کے لیے نتائج کی بہتر نارملائزیشن کو یقینی بناتا ہے۔دوسرا، یہ mRNA کی افزودگی کے مرحلے سے گریز کرتا ہے، جو مختلف mRNAs کی مختلف بازیافتوں کی وجہ سے ترچھے نتائج کے امکان سے بچ سکتا ہے۔مجموعی طور پر، چونکہ زیادہ تر ایپلی کیشنز میں ٹارگٹ جین کی متعلقہ مقدار کا تعین پتہ لگانے کی مطلق حساسیت سے زیادہ اہم ہے، زیادہ تر معاملات میں کل RNA زیادہ موزوں ہے۔

ریورس ٹرانسکرپشن پرائمر

دو قدمی طریقہ کار میں، cDNA کے رد عمل کو پرائم کرنے کے لیے تین مختلف طریقے استعمال کیے جا سکتے ہیں: oligo(dT) پرائمر، بے ترتیب پرائمر، یا ترتیب سے متعلق پرائمر۔عام طور پر، oligo(dT) پرائمر اور بے ترتیب پرائمر مجموعہ میں استعمال ہوتے ہیں۔یہ پرائمر ٹیمپلیٹ mRNA اسٹرینڈ سے منسلک ہوتے ہیں اور ترکیب کے لیے نقطہ آغاز کے ساتھ ریورس ٹرانسکرپٹیز فراہم کرتے ہیں۔

آرٹیکل 2

پرائمر کا انتخاب ساخت اور فنکشن فائدہ نقصان
اولیگو (ڈی ٹی) پرائمر (یا اینکرڈ اولیگو (ڈی ٹی) پرائمر) mRNA کی پولی(A) دم پر تھامین کی باقیات کو توسیعی اینیلنگ؛اینکر اولیگو (ڈی ٹی) پرائمر میں 3′ کے آخر میں ایک G، C، یا A ہوتا ہے (اینکر سائٹ) پولی (A) ٹیلڈ mRNA سے پوری لمبائی والے سی ڈی این اے کی ترکیب

 

لاگو ہوتا ہے جب کم شروع کرنے والا مواد دستیاب ہو۔

 

اینکرنگ سائٹ اس بات کو یقینی بناتی ہے کہ اولیگو (dT) پرائمر mRNA کی 5′ پولی (A) دم سے جڑا ہوا ہے۔

صرف پولی (A) دم کے ساتھ جین کو بڑھانے کے لیے موزوں ہے۔

 

پولی(A) میں پرائمنگ سائٹ*2 سے کٹا ہوا cDNA حاصل کریں۔

 

3′ اختتام پر پابند ہونے کے لیے متعصب*

 

اگر اینکرڈ اولیگو (ڈی ٹی) پرائمر استعمال کیے جائیں تو یہ امکان کم ہو جاتا ہے۔

بے ترتیب پرائمر

 

لمبائی میں 6 سے 9 بیسز، جو RNA ٹرانسکرپشن کے دوران ایک سے زیادہ سائٹس کو اینیل کر سکتے ہیں۔ تمام RNAs (tRNA، rRNA، اور mRNA) سے جڑنا

 

اہم ثانوی ساخت کے ساتھ نقلوں کے لیے موزوں ہے، یا جب کم ابتدائی مواد دستیاب ہو۔

 

اعلی سی ڈی این اے پیداوار

سی ڈی این اے کو تمام آر این اے سے الٹا نقل کیا جاتا ہے، جو عام طور پر مطلوب نہیں ہوتا ہے اور ہدف ایم آر این اے کے سگنل کو کمزور کر سکتا ہے۔

 

کٹا ہوا سی ڈی این اے حاصل کریں۔

ترتیب کے لیے مخصوص پرائمر مخصوص ایم آر این اے کی ترتیب کو نشانہ بنانے والے کسٹم پرائمر مخصوص سی ڈی این اے لائبریری

 

حساسیت کو بہتر بنائیں

 

ریورس کیو پی سی آر پرائمر کا استعمال

صرف ایک ہدف جین کی ترکیب تک محدود

ریورس ٹرانسکرپٹیس

ریورس ٹرانسکرپٹیس ایک انزائم ہے جو ڈی این اے کی ترکیب کے لیے آر این اے کا استعمال کرتا ہے۔کچھ ریورس ٹرانسکرپٹیسز میں RNase سرگرمی ہوتی ہے اور وہ ٹرانسکرپشن کے بعد RNA-DNA ہائبرڈ اسٹرینڈز میں RNA اسٹرینڈز کو کم کر سکتے ہیں۔اگر اس میں RNase انزیمیٹک سرگرمی نہیں ہے تو، اعلی qPCR کی کارکردگی کے لیے RNaseH کو شامل کیا جا سکتا ہے۔عام طور پر استعمال ہونے والے انزائمز میں مولونی مورائن لیوکیمیا وائرس ریورس ٹرانسکرپٹیز اور ایویئن مائیلوبلاسٹوما وائرس ریورس ٹرانسکرپٹس شامل ہیں۔RT-qPCR کے لیے، اعلی تھرموسٹیبلٹی کے ساتھ ریورس ٹرانسکرپٹیس کا انتخاب کرنا مثالی ہے، تاکہ سی ڈی این اے کی ترکیب کو اعلی درجہ حرارت پر انجام دیا جا سکے، اعلی ثانوی ساخت کے ساتھ RNAs کی کامیاب نقل کو یقینی بناتے ہوئے، پورے رد عمل میں ان کی مکمل سرگرمی کو برقرار رکھتے ہوئے، جس کے نتیجے میں سی ڈی این اے کی پیداوار زیادہ ہوتی ہے۔

متعلقہ مصنوعات:

Foreasy M-MLV ریورس ٹرانسکرپٹیس

ریورس ٹرانسکرپٹیس کی RNase H سرگرمی

RNaseH RNA-DNA ڈوپلیکس سے RNA اسٹرینڈز کو کم کرنے کے قابل ہے، جس سے ڈبل پھنسے ہوئے DNA کی موثر ترکیب کی اجازت دی جا سکتی ہے۔تاہم، طویل ایم آر این اے کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کرتے وقت، آر این اے وقت سے پہلے انحطاط پذیر ہو سکتا ہے، جس کے نتیجے میں سی ڈی این اے کٹ جاتا ہے۔لہذا، سی ڈی این اے کلوننگ کے دوران RNaseH سرگرمی کو کم کرنا اکثر فائدہ مند ہوتا ہے اگر طویل نقلوں کی ترکیب مطلوب ہو۔اس کے برعکس، RNase H سرگرمی کے ساتھ ریورس ٹرانسکرپٹس اکثر qPCR ایپلی کیشنز کے لیے فائدہ مند ہوتے ہیں کیونکہ وہ PCR کے پہلے چکر کے دوران RNA-DNA ڈوپلیکس کے پگھلنے کو بڑھاتے ہیں۔

پرائمر ڈیزائن

RT-qPCR میں qPCR قدم کے لیے استعمال ہونے والے PCR پرائمر کو مثالی طور پر ایک exon-exon جنکشن تک پھیلانے کے لیے ڈیزائن کیا جانا چاہیے، جہاں ایک ایمپلیفیکیشن پرائمر ممکنہ طور پر ایک حقیقی exon-intron باؤنڈری کو پھیلا سکتا ہے۔چونکہ انٹرن پر مشتمل جینومک ڈی این اے کی ترتیب کو بڑھاوا نہیں دیا گیا ہے، اس لیے یہ ڈیزائن جینومک ڈی این اے کو آلودہ کرنے سے بڑھے ہوئے جھوٹے مثبتات کے خطرے کو کم کرتا ہے۔

اگر پرائمر کو exons یا exon-exon حدود کو الگ کرنے کے لیے ڈیزائن نہیں کیا جا سکتا ہے، تو یہ ضروری ہو سکتا ہے کہ RNA نمونوں کا علاج RNase-free DNase I یا dsDNase کے ساتھ کیا جائے تاکہ جینومک DNA آلودگی کو دور کیا جا سکے۔

RT-qPCR کنٹرول

ڈی این اے کی آلودگی کا پتہ لگانے کے لیے تمام RT-qPCR تجربات میں ریورس ٹرانسکرپشن نیگیٹو کنٹرول (-RT کنٹرول) شامل کیا جانا چاہیے (جیسے جینومک DNA یا PCR پروڈکٹس پچھلے رد عمل سے)۔یہ کنٹرول ریورس ٹرانسکرپٹیس کے علاوہ تمام ردعمل کے اجزاء پر مشتمل ہے۔چونکہ اس کنٹرول کے ساتھ ریورس ٹرانسکرپشن نہیں ہوتا ہے، اگر پی سی آر ایمپلیفیکیشن کا مشاہدہ کیا جائے تو، ڈی این اے سے آلودگی کا زیادہ امکان ہے۔


پوسٹ ٹائم: اگست 02-2022