CoVID-19 ایک متعدی بیماری ہے جو شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم کورونا وائرس ٹائپ 2 کی وجہ سے ہوتی ہے۔ جب کوئی شخص متاثر ہوتا ہے تو سب سے عام علامات میں بخار، کھانسی اور سانس کی قلت شامل ہوتی ہے۔
جانچ کے لیے استعمال کیے جانے والے نمونے nasopharyngeal swabs یا oropharyngeal swabs کے ذریعے جمع کیے جا سکتے ہیں۔
کورونا وائرس کا پتہ لگانے کا معیاری طریقہ پولیمریز چین ری ایکشن، پی سی آر ہے۔یہ ایک طریقہ ہے جو سالماتی حیاتیات میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا ہے۔یہ تیزی سے لاکھوں سے اربوں مخصوص ڈی این اے کے ٹکڑوں کو کاپی کر سکتا ہے۔
نئے کورونا وائرس میں ایک بہت طویل سنگل اسٹرینڈڈ RNA جینوم ہوتا ہے۔پی سی آر کے ذریعے ان وائرسوں کا پتہ لگانے کے لیے، آر این اے مالیکیولز کو ان کے تکمیلی ڈی این اے کی ترتیب میں ریورس ٹرانسکرپٹیس کے ذریعے تبدیل کرنا ضروری ہے، اور پھر نئے ترکیب شدہ ڈی این اے کو معیاری پی سی آر طریقہ کار کے ذریعے بڑھایا جا سکتا ہے، جسے عام طور پر RT-PCR کے نام سے جانا جاتا ہے۔
RT-PCR عمل
آر این اے نکالنا
اس طریقہ کو انجام دینے کے لیے، وائرل آر این اے کو بنیادی طور پر نکالا جانا چاہیے۔آر این اے پیوریفیکیشن کٹس کی ایک قسم آسان، تیز اور موثر علیحدگی کے لیے استعمال کی جا سکتی ہے۔
ایک کمرشل کٹ کا استعمال کرتے ہوئے وائرل RNA نکالنے کے لیے، پہلے نمونے کو ایک مائیکرو سینٹرفیوج ٹیوب میں شامل کریں اور پھر اسے لیسیز بفر کے ساتھ ملا دیں۔یہ بفر انتہائی منحرف ہے اور عام طور پر فینول اور guanidine isothiocyanate پر مشتمل ہوتا ہے۔اس کے علاوہ، RNase inhibitors عام طور پر lysis بفر میں موجود ہوتے ہیں تاکہ برقرار وائرل RNA کی تنہائی کو یقینی بنایا جا سکے۔
لیسیز بفر کو شامل کرنے کے بعد، مکسنگ ٹیوب کو نبض کے ذریعے بھنور کریں اور کمرے کے درجہ حرارت پر انکیوبیٹ کریں۔اس کے بعد وائرس کو لیسس بفر کے ذریعہ فراہم کردہ انتہائی ناقص حالات میں لیس کیا جاتا ہے۔
نمونے کو لیس کرنے کے بعد، ایک سینٹرفیوج ٹیوب کو صاف کرنے کے طریقہ کار کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔نمونے کو سینٹری فیوج ٹیوب میں لوڈ کیا جاتا ہے اور پھر سینٹرفیوج کیا جاتا ہے۔
یہ طریقہ کار ایک ٹھوس فیز نکالنے کا طریقہ ہے جس میں سٹیشنری فیز سلکا جیل میٹرکس پر مشتمل ہوتا ہے۔
زیادہ سے زیادہ نمک اور پی ایچ حالات میں، آر این اے کے مالیکیول سلکا جھلی سے جڑ جاتے ہیں۔
ایک ہی وقت میں، پروٹین اور دیگر آلودگیوں کو ہٹا دیا جاتا ہے.
سینٹرفیوگریشن کے بعد، سینٹری فیوج ٹیوب کو صاف کلیکشن ٹیوب میں ڈالیں، فلٹریٹ کو ضائع کریں، اور پھر واشنگ بفر شامل کریں۔
جھلی کے ذریعے واش بفر کو زبردستی کرنے کے لیے ٹیوب کو دوبارہ سینٹری فیوج میں رکھیں۔یہ جھلی سے باقی تمام نجاستوں کو ہٹا دے گا، صرف آر این اے کو سیلیکا جیل سے جکڑ دیا جائے گا۔
نمونے کو دھونے کے بعد، ٹیوب کو صاف مائیکرو سینٹرفیوج ٹیوب میں ڈالیں اور ایلیوشن بفر شامل کریں۔
اس کے بعد اسے جھلی کے ذریعے الیوشن بفر کو زبردستی کرنے کے لیے سینٹرفیوج کیا جاتا ہے۔الیوشن بفر اسپن کالم سے وائرل RNA کو ہٹاتا ہے اور پروٹین، روکنے والوں اور دیگر آلودگیوں سے پاک RNA حاصل کرتا ہے۔
مخلوط ارتکاز
وائرل آر این اے کو نکالنے کے بعد، اگلا مرحلہ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے لیے رد عمل کا مرکب تیار کرنا ہے۔اس مرحلے میں، توجہ مرکوز کا استعمال کیا جاتا ہے.یہ مرتکز محلول ایک پریمکسڈ مرتکز محلول ہے جس میں پریمکس، ریورس ٹرانسکرپٹیس، نیوکلیوٹائڈس، فارورڈ پرائمر، ریورس پرائمر، تقمان پروب اور ڈی این اے پولیمریز شامل ہیں۔
آخر میں، اس ردعمل کے مرکب کو مکمل کرنے کے لیے، RNA ٹیمپلیٹ شامل کیا جاتا ہے۔ٹیوبوں کو نبض کے بھنور کے ذریعے ملایا جاتا ہے، اور پھر رد عمل کا مرکب پی سی آر پلیٹ میں لوڈ کیا جاتا ہے۔پی سی آر پلیٹ میں عام طور پر 96 کنویں ہوتے ہیں اور ایک ہی وقت میں متعدد نمونوں کا تجزیہ کر سکتے ہیں۔
پی سی آر پروردن
اس کے بعد، پلیٹ کو پی سی آر مشین میں رکھیں، جو کہ بنیادی طور پر تھرمل سائیکلر ہے۔
RdrRP جین، E جین اور N جین میں ہدف کی ترتیب کو بڑھا کر 2019 کے نوول کورونا وائرس کا پتہ لگانے کے لیے ریئل ٹائم RT-PCR استعمال کیا جاتا ہے۔ہدف جین کا انتخاب پرائمر اور تحقیقات کی ترتیب پر منحصر ہے۔
RT-PCR کا پہلا مرحلہ ریورس ٹرانسکرپشن ہے۔تکمیلی DNA کا پہلا اسٹرینڈ ترکیب کیا جاتا ہے، جو PCR ریورس پرائمر کے ذریعے شروع کیا جاتا ہے، جو وائرل RNA جینوم کے تکمیلی حصے سے منسلک ہوتا ہے۔پھر ریورس ٹرانسکرپٹیس DNA نیوکلیوٹائڈز کو پرائمر کے 3′سرے میں شامل کرتا ہے تاکہ وائرل RNA کے تکمیلی DNA کی ترکیب کی جا سکے۔اس مرحلے کا درجہ حرارت اور دورانیہ پرائمر، ہدف RNA، اور استعمال شدہ ریورس ٹرانسکرپٹیس پر منحصر ہے۔
اس کے بعد، ایک ابتدائی denaturation قدم لاگو کیا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں RNA-DNA ہائبرڈ کی کمی ہوتی ہے۔یہ قدم ڈی این اے پولیمریز کو چالو کرنے کے لیے ضروری ہے۔ایک ہی وقت میں، ریورس ٹرانسکرپٹیس غیر فعال ہے.
پی سی آر تھرمل سائیکلوں کی ایک سیریز پر مشتمل ہے۔ہر سائیکل ڈینیچریشن، اینیلنگ اور ایکسٹینشن کے مراحل پر مشتمل ہوتا ہے۔
ڈینیچریشن کے مرحلے میں رد عمل کے چیمبر کو 95 ڈگری سیلسیس پر گرم کرنا اور اسے ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے ٹیمپلیٹ کی خرابی کے لیے استعمال کرنا شامل ہے۔
اگلے مرحلے میں، رد عمل کا درجہ حرارت 58 ڈگری سینٹی گریڈ تک کم کر دیا جاتا ہے، جس سے فارورڈ پرائمر اس کے سنگل پھنسے ہوئے DNA ٹیمپلیٹ کے تکمیلی حصے سے منسلک ہو جاتا ہے۔اینیلنگ کا درجہ حرارت براہ راست پرائمر کی لمبائی اور ساخت پر منحصر ہے۔
توسیعی مرحلے میں، ڈی این اے پولیمریز ایک نئے ڈی این اے اسٹرینڈ کی ترکیب کرتا ہے جو ڈی این اے ٹیمپلیٹ اسٹرینڈ کی تکمیل کرتا ہے۔ری ایکشن مکسچر سے 5′سے 3′ڈائریکشن میں ٹیمپلیٹ میں مفت نیوکللی کو شامل کر کے۔اس مرحلے کا درجہ حرارت استعمال ہونے والے ڈی این اے پولیمریز پر منحصر ہے۔
پہلے سائیکل کے بعد، ایک ڈبل پھنسے ہوئے DNA ہدف حاصل کیا جاتا ہے۔
پھر، دوسرا چکر داخل کریں۔ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے کو دو واحد پھنسے ہوئے ڈی این اے مالیکیولز بنانے کے لیے ڈینیچر کیا جاتا ہے۔
اگلے مرحلے میں، رد عمل کا درجہ حرارت کم کر دیا جاتا ہے، پرائمر کو ہر ایک پھنسے ہوئے DNA ٹیمپلیٹ سے منسلک کر دیا جاتا ہے، اور Taq-man پروب کو ہدف DNA کے تکمیلی حصے سے منسلک کر دیا جاتا ہے۔
TaqMan پروب ایک فلوروفور پر مشتمل ہوتا ہے جو ہم آہنگی کے ساتھ اولیگونوکلیوٹائڈ پروب کے 5′سرے سے منسلک ہوتا ہے۔جب سائیکلر کے روشنی کے منبع سے پرجوش ہوتا ہے، تو فلوروفور فلوروسینس خارج کرتا ہے۔اس کے علاوہ، تحقیقات 3′ آخر میں ایک بجھانے والے پر مشتمل ہے۔بجھانے والے سے رپورٹر جین کی قربت فلوروسینس کا پتہ لگانے سے روکتی ہے۔
توسیعی مرحلے میں، ڈی این اے پولیمریز ایک نئے اسٹرینڈ کی ترکیب کرتا ہے۔جب پولیمریز تاقمان پروب تک پہنچتا ہے، تو اس کی اینڈوجینس 5′نیوکلیز سرگرمی پروب کو بند کر دیتی ہے، جس سے رنگ کو بجھانے والے سے الگ ہو جاتا ہے۔
پی سی آر کے ہر چکر کے ساتھ، مزید ڈائی مالیکیولز جاری کیے جاتے ہیں، جس کے نتیجے میں فلوروسینس کی شدت میں اضافہ ہوتا ہے جو کہ ترکیب شدہ امپلیون کی تعداد کے متناسب ہوتا ہے۔
یہ طریقہ نمونے میں موجود کسی ترتیب کی تعداد کا اندازہ لگانے کی اجازت دیتا ہے۔دوہری پھنسے ہوئے ڈی این اے کے ٹکڑوں کی تعداد ہر چکر میں دگنی ہوجاتی ہے۔لہذا، پی سی آر کو بہت چھوٹے نمونوں کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
فلوروسینٹ سگنل کی پیمائش کے لیے، ٹنگسٹن ہالوجن لیمپ، اکسیٹیشن فلٹر، ریفلیکٹر، لینس، ایمیشن فلٹر اور چارج کپلڈ ڈیوائس استعمال سی سی ڈی کیمرہ۔
مرحلہ 4 پتہ لگائیں۔
فلوروسینٹ سگنل کی پیمائش کے لیے، ٹنگسٹن ہالوجن لیمپ، اکسیٹیشن فلٹر، ریفلیکٹر، لینس، ایمیشن فلٹر اور چارج کپلڈ ڈیوائس استعمال سی سی ڈی کیمرہ۔
چراغ سے فلٹر شدہ روشنی ریفلیکٹر سے منعکس ہوتی ہے، کنڈینسر لینس سے گزرتی ہے، اور ہر سوراخ کے مرکز میں مرکوز ہوتی ہے۔پھر سوراخ سے خارج ہونے والا فلوروسینس آئینے سے منعکس ہوتا ہے، ایمیشن فلٹر سے گزرتا ہے، اور سی سی ڈی کیمرے کے ذریعے اس کا پتہ لگایا جاتا ہے۔ہر پی سی آر سائیکل میں، سی سی ڈی کے ذریعہ خود پرجوش فلوروفور لائٹ کا پتہ لگایا جاسکتا ہے۔
یہ پکڑی ہوئی روشنی کو ڈیجیٹل ڈیٹا میں بدل دیتا ہے۔اس طریقہ کو ریئل ٹائم پی سی آر کہا جاتا ہے، اور یہ پی سی آر کے رد عمل کی پیش رفت کی حقیقی وقت کی نگرانی کی اجازت دیتا ہے۔
پوسٹ ٹائم: جولائی 19-2021