RT-qPCR مالیکیولر بائیولوجی کا بنیادی تجربہ ہے، اور ہر ایک کو اس سے واقف ہونا چاہیے۔اس میں بنیادی طور پر تین مراحل شامل ہیں: آر این اے نکالنا، سی ڈی این اے میں نقل نقل کرنا، اور ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری پی سی آر۔یہ مدد نہیں کرتا، کیا ہو رہا ہے؟اس کے ساتھ ایک مسئلہ ہے کہ امکان ہےریورس ٹرانسکرپشن تجربہ!اگرچہ ایسا لگتا ہے کہ ریورس ٹرانسکرپشن کے تجربے میں صرف RNA، dNTP، پرائمر، اور شامل کرنے کی ضرورت ہے۔ریورس ٹرانسکرپٹیسسینٹری فیوج ٹیوب تک اور اچھی طرح مکس کریں، لیکن اصل آپریشن کے عمل میں، اب بھی بہت سی تفصیلات ہیں جن پر توجہ دینے کی ضرورت ہے۔آئیے اس کے بارے میں جانیں!

آر این اے کے معیار کا فیصلہ کیسے کریں؟
سی ڈی این اے حاصل کرنے کے لیے، آر این اے کا معیار اہم ہے!آر این اے کے معیار کو بنیادی طور پر دو پہلوؤں سے معلوم کیا جا سکتا ہے:
(1) آر این اے کی سالمیت:آر این اے کی سالمیت کی تصدیق ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ کی جاسکتی ہے۔. مثال کے طور پر یوکریوٹس کو لے کر، مکمل کل RNA میں تین واضح بینڈ ہیں، بڑے سے چھوٹے تک مالیکیولر وزن 28S، 18S، اور 5S ہیں، اور 28S 18S سے دوگنا روشن ہے۔اگر تین بینڈ دیکھے جا سکتے ہیں، لیکن بینڈ کی قسم دھندلی ہے یا پھیلاؤ کا مطلب ہے کہ RNA جزوی طور پر تنزلی کا شکار ہے۔اس وقت، براہ کرم ریورس ٹرانسکرپشن ردعمل کو فوری طور پر انجام دیں اور ٹیمپلیٹ ان پٹ کو مناسب طریقے سے بڑھائیں۔اگر چھوٹے مالیکیولر وزن کے ساتھ صرف ایک بینڈ یا کوئی بینڈ نہیں دیکھا جا سکتا ہے، تو RNA مکمل طور پر خراب ہو چکا ہے اور اسے دوبارہ نکالنے کی ضرورت ہے۔Agilent 2100 چوٹی ڈایاگرام اور RIN قدر کے ساتھ RNA کی سالمیت کی نشاندہی کرتا ہے۔اگر نیوکلک ایسڈ برقرار ہے تو الیکٹرو فیروگرام کی بیس لائن چپٹی ہے۔اگر نیوکلک ایسڈ شدید طور پر تنزلی کا شکار ہے، تو بیس لائن ناہموار ہے اور مزید تنزلی کی چوٹیاں نمودار ہوتی ہیں۔RIN کی قدر RNA کی سالمیت کو ظاہر کرتی ہے، 0-10 کی حد میں، قدر جتنی بڑی ہوگی، RNA کا معیار اتنا ہی بہتر ہوگا۔ٹھیک ہے، مکمل ہونے کی ڈگری زیادہ ہے.
(2) آر این اے کی پاکیزگی:OD260/280 کا تناسب UV سپیکٹرو فوٹومیٹری سے معلوم کیا جا سکتا ہے۔اگر OD260/280 کا تناسب 1.9 اور 2.1 کے درمیان ہے تو پاکیزگی بہت اچھی ہے۔
بقایا جینومک ڈی این اے غلط مقداری نتائج کا باعث بن سکتا ہے۔
جب آر این اے نکالا جاتا ہے، تو ہمیں جو آر این اے ملتا ہے وہ جینومک ڈی این اے (جی ڈی این اے) کے ساتھ مل سکتا ہے جو صاف نہیں ہوا ہے۔لہذا، ریورس ٹرانسکرپشن کے بعد سی ڈی این اے کو بھی ملایا جائے گا۔جی ڈی این اے.بہاو ​​کے دورانکیو پی سی آرردعمل،سی ڈی این اےاور جی ڈی این اے کو بیک وقت بڑھایا جا سکتا ہے، جس کے نتیجے میں نسبتاً چھوٹی سی ٹی ویلیو ہوتی ہے، اس لیے نتائج متعصب ہو سکتے ہیں۔
تو اس صورت حال میں ہمیں کیا کرنا چاہیے؟فارجینپتہ چلتا ہے:
(1) الٹ RNA پر جینوم کی صفائی کریں، جسے RNA نکالنے کے دوران کالم نکال کر ہٹایا جا سکتا ہے۔
(2) نکالے گئے RNA کا DNase سے علاج کریں۔I ، لیکن اسے EDTA کے ساتھ ختم کریں۔
ریورس ٹرانسکرپشن ری ایجنٹس کاجینوم کلیئرنگ ماڈیولز کے ساتھ؛

ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے پرائمر کا انتخاب کیسے کریں؟
ریورس ٹرانسکرپشن پرائمر ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن کے نتائج کو بھی متاثر کرتے ہیں۔آپ تجربے کے مخصوص حالات کے مطابق ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے بے ترتیب پرائمر، اولیگو ڈی ٹی یا جین کے لیے مخصوص پرائمر کا انتخاب کر سکتے ہیں:
(1) مخصوص نقلیں: جین کے لیے مخصوص پرائمر تجویز کیے جاتے ہیں۔
(2) لمبے ٹکڑے کی نقل: اولیگو ڈی ٹی/جین کے لیے مخصوص پرائمر تجویز کیے جاتے ہیں۔
(3) طویل سیگمنٹ ٹرانسکرپٹس کے اندرونی ٹکڑے: جین کے لیے مخصوص پرائمر/ رینڈم پرائمر/ رینڈم پرائمر + اولیگو ڈی ٹی۔اگر بعد میں qPCR کا تجربہ کیا جاتا ہے تو، Oligo dT کو اکیلے استعمال نہیں کیا جا سکتا، کیونکہ اکیلے Oligo dT کا استعمال 3′ اختتامی تعصب کا سبب بن سکتا ہے، جس کے نتیجے میں qPCR تجربات کے غلط نتائج نکلتے ہیں۔
(4) miRNA: اسٹیم لوپ پرائمر یا ٹیلنگ پرائمر استعمال کیے جا سکتے ہیں۔

کوانٹیفیکیشن کے لیے ریورس ٹرانسکرپشن پروڈکٹ سی ڈی این اے کو کتنی بار پتلا کیا جانا چاہیے؟
ریورس ٹرانسکرپشن پروڈکٹ کا سی ڈی این اے حاصل کرنے کے بعد، کیو پی سی آر کے تجربات کے لیے سی ڈی این اے کو کتنی بار پتلا کرنا بہت ضروری ہے۔اگر سی ڈی این اے کا ارتکاز بہت زیادہ یا بہت کم ہے تو امپلیفیکیشن کی کارکردگی متاثر ہو سکتی ہے۔کیا cDNA کی حراستی کی پیمائش کی جا سکتی ہے، اور اسے کیسے کیا جانا چاہیے؟
(1) ریورس ٹرانسکرپشن پروڈکٹ کی سی ڈی این اے ارتکاز کو ماپا نہیں جا سکتا، کیونکہ سی ڈی این اے پروڈکٹ کے علاوہ، ریورس ٹرانسکرپشن پروڈکٹ میں ریورس ٹرانسکرپشن ریزیڈیول بفر، ریورس ٹرانسکرپٹیز، پرائمر وغیرہ بھی ہوتے ہیں، جو ارتکاز کی پیمائش کے نتائج میں مداخلت کرتے ہیں اور اس وجہ سے OD260/280، OD260/280، OD236، OD260/280 اور ODNRAT کی عکاسی نہیں کرتے۔ میداناس وقت کچھ دوست کہیں گے کہ تطہیر کے بعد ارتکاز ناپوں گا۔یہاں، فورجین یاد دلانا چاہیں گے کہ سی ڈی این اے کو صاف کرنے کی سفارش نہیں کی گئی ہے، کیونکہ الٹنے سے حاصل ہونے والے سی ڈی این اے کی لمبائی مختلف ہے، اور مختصر سی ڈی این اے طہارت میں ضائع ہو جائے گا۔
(2) تو کیا کیا جائے؟کیو پی سی آر کے تجربے سے پہلے، سی ڈی این اے کے کم ہونے والے میلان کا تعین پری تجربے کے ذریعے کیا جا سکتا ہے۔مثال کے طور پر: cDNA سٹاک سلوشن، 10-fold dilution، اور 100-fold dilution کو qPCR تجربات کے لیے ٹیمپلیٹس کے طور پر استعمال کریں، اور 18-28 کی رینج میں CT ویلیو کے ساتھ dilution عنصر کو منتخب کریں۔

miRNAs کو ریورس ٹرانسکرائب کیسے کیا جانا چاہئے؟
miRNA ایک واحد پھنسے ہوئے چھوٹے مالیکیول RNA ہے جس کا سائز تقریباً 22 nt ہے جو پروٹین کے لیے کوڈ نہیں کرتا ہے۔اس کی مختصر لمبائی کی وجہ سے، روایتی qPCR طریقہ سے اس کی براہ راست مقدار درست کرنا مشکل ہے، اس لیے اکثر miRNA کو بڑھانا ضروری ہوتا ہے۔miRNA کے لیے عام طور پر استعمال ہونے والے ریورس ٹرانسکرپشن کے طریقوں میں اسٹیم لوپ طریقہ اور ٹیلنگ کا طریقہ شامل ہے۔
اسٹیم لوپ کا طریقہ اسٹیم لوپ پرائمر شامل کرکے miRNA کو بڑھانا ہے۔پتہ لگانے کے اس طریقے میں زیادہ حساسیت اور خاصیت ہے، لیکن پتہ لگانے کا طریقہ کم ہے۔ایک ریورس ٹرانسکرپشن صرف ایک miRNA اور ایک اندرونی حوالہ کا پتہ لگا سکتا ہے۔دم جوڑنے کا طریقہ دو پر مشتمل ہے یہ دو خامروں کے مشترکہ عمل سے مکمل ہوتا ہے، جو کہ پولی اے پولیمریز اور ریورس ٹرانسکرپٹیز ہیں۔پولی اے پولیمریز اس کی لمبائی بڑھانے کے لیے پولی اے ٹیلز کو miRNA میں شامل کرنے کے لیے ذمہ دار ہے، اور ریورس ٹرانسکرپٹیس ریورس ٹرانسکرپشن رد عمل انجام دیتا ہے۔اس طریقہ کا پتہ لگانے کا تھرو پٹ زیادہ ہے اور یہ ایک الٹ ٹرانسکرپشن میں متعدد miRNAs اور اندرونی حوالوں کا پتہ لگا سکتا ہے، لیکن سٹیم لوپ طریقہ میں حساسیت اور مخصوصیت کم ہے۔