• فیس بک
  • لنکڈ
  • یوٹیوب

پی سی آر سب سے زیادہ استعمال ہونے والی نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی ہے اور اس کی حساسیت اور مخصوصیت کی وجہ سے بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی ہے۔تاہم، پی سی آر کو بار بار تھرمل ڈینیچریشن کی ضرورت ہوتی ہے اور وہ آلات اور آلات پر انحصار کرنے کی حدود سے چھٹکارا حاصل نہیں کر سکتا، جو کلینیکل فیلڈ ٹیسٹنگ میں اس کے اطلاق کو محدود کرتی ہے۔

1990 کی دہائی کے اوائل سے، بہت سی لیبارٹریوں نے درجہ حرارت میں اضافہ کرنے والی مستقل ٹیکنالوجی تیار کرنا شروع کر دی ہے جس کے لیے تھرمل ڈینیچریشن کی ضرورت نہیں ہے۔اب انہوں نے لوپ میڈیٹڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی، اسٹرینڈ ریپلیسمنٹ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی، رولنگ سرکل آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی، اور نیوکلک ایسڈ سیکوئنس انحصار تیار کیا ہے۔Isothermal ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی اور دیگر ٹیکنالوجیز۔ 

Loop-ثالثی isothermal amplification

ایمپلیفیکیشن اصول اس حقیقت پر مبنی ہے کہ ڈی این اے تقریبا 65 ° C پر متحرک توازن کی حالت میں ہے۔جب کسی بھی پرائمر کو بیس جوڑا بنایا جاتا ہے اور اسے ڈبل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کے تکمیلی حصے تک بڑھایا جاتا ہے، تو دوسرا اسٹرینڈ الگ ہو جائے گا اور سنگل اسٹرینڈ ہو جائے گا۔

اس درجہ حرارت پر، ڈی این اے 4 مخصوص پرائمر استعمال کرتا ہے تاکہ اسٹرینڈ ڈسپلیسمنٹ ڈی این اے پولیمریز پر بھروسہ کیا جا سکے تاکہ اسٹرینڈ ڈسپلیسمنٹ ڈی این اے کی ترکیب کو مسلسل خود گردش کیا جا سکے۔

پہلے ٹارگٹ جین پر 6 مخصوص علاقوں F3, F2, F1, B1, B2, B3 کا تعین کریں اور پھر ان 6 مخصوص خطوں کی بنیاد پر 4 پرائمر ڈیزائن کریں (جیسا کہ نیچے کی تصویر میں دکھایا گیا ہے):

فارورڈ اندرونی پرائمر (FIP) F1c اور F2 پر مشتمل ہے۔

پسماندہ اندرونی پرائمر (BIP) B1c اور B2 پر مشتمل ہے، اور TTTT درمیان میں اسپیسر کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔

بیرونی پرائمر F3 اور B3 بالترتیب ہدف جین پر F3 اور B3 خطوں پر مشتمل ہیں۔

نیوکلک ایسڈ آئسوتھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی

LAMP ردعمل کے نظام میں، اندرونی پرائمر کا ارتکاز بیرونی پرائمر سے کئی گنا زیادہ ہے۔اندرونی پرائمر کو پہلے ٹیمپلیٹ اسٹرینڈ کے ساتھ ملایا جاتا ہے تاکہ ڈی این اے ڈبل اسٹرینڈ بنانے کے لیے تکمیلی اسٹرینڈ کی ترکیب کی جاسکے۔اس کے بعد، بیرونی پرائمر کو ٹیمپلیٹ اسٹرینڈ کے ساتھ ملا کر ڈی این اے ڈبل اسٹرینڈ بنایا جاتا ہے۔BstDNA پولیمریز کی کارروائی کے تحت، اندرونی پرائمر کے ذریعہ ترکیب شدہ تکمیلی اسٹرینڈ جاری کیا جاتا ہے۔رد عمل کی ایک سیریز کے بعد، تکمیلی اسٹرینڈ آخر کار ڈمبل ڈھانچے کے ساتھ ایک واحد DNA اسٹرینڈ بناتا ہے۔

ڈمبل ڈھانچہ ڈی این اے سنگل اسٹرینڈ خود کو ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے تاکہ ایک کھلے سرے کے ساتھ ایک عبوری اسٹیم لوپ ڈھانچہ ڈی این اے کو مسلسل بنایا جاسکے۔اندرونی اور بیرونی پرائمر عبوری اسٹیم لوپ ڈھانچہ DNA کی رہنمائی کرتے ہیں تاکہ مسلسل اسٹرینڈ ڈسپلسمنٹ اور ایکسٹینشن ری ایکشنز سے گزرے، اور آخر کار مختلف لمبائیوں کے ساتھ متعدد اسٹیم لوپ ڈھانچے کی تشکیل کرے۔ڈی این اے مرکب۔

نیوکلک ایسڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی 2

لوپ ثالثی آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن کے فوائد اور نقصانات

LAMP کے فوائد:

(1) ہائی ایمپلیفیکیشن ایفیشنسی، جو 1 گھنٹے کے اندر ٹارگٹ جین کی 1-10 کاپیوں کو مؤثر طریقے سے بڑھا سکتی ہے، اور ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی عام پی سی آر سے 10-100 گنا ہے۔

(2) ردعمل کا وقت مختصر ہے، خاصیت مضبوط ہے، اور کسی خاص سامان کی ضرورت نہیں ہے۔

LAMP کی خامیاں:

(1) پرائمر کی ضروریات خاص طور پر زیادہ ہیں۔

(2) ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کو کلوننگ اور ترتیب کے لیے استعمال نہیں کیا جا سکتا، بلکہ صرف فیصلے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

(3) اس کی مضبوط حساسیت کی وجہ سے، ایروسول بنانا آسان ہے، جو غلط مثبت کا باعث بنتا ہے اور ٹیسٹ کے نتائج کو متاثر کرتا ہے۔

Sنقل مکانی پروردن

اسٹرینڈ ڈسپلیسمنٹ ایمپلیفیکیشن (SDA) ایک ان وٹرو آئسوتھرمل ڈی این اے ایمپلیفیکیشن تکنیک ہے جو 1992 میں پہلی بار امریکی اسکالر واکر کے ذریعہ تجویز کردہ انزیمیٹک ردعمل پر مبنی ہے۔

ایس ڈی اے کے بنیادی نظام میں ایک پابندی اینڈونکلیز، اسٹرینڈ ڈسپلیسمنٹ سرگرمی کے ساتھ ایک ڈی این اے پولیمریز، پرائمر کے دو جوڑے، ڈی این ٹی پی، اور کیلشیم اور میگنیشیم آئنز اور بفر سسٹم شامل ہیں۔

اسٹرینڈ ڈسپلیسمنٹ ایمپلیفیکیشن کا اصول ٹارگٹ ڈی این اے کے دونوں سروں پر کیمیاوی طور پر ترمیم شدہ پابندی اینڈونکلیز ریکگنیشن ترتیب پر مبنی ہے۔اینڈونکلیز اسٹرینڈ ڈی این اے میں موجود خلا کو اپنی شناخت کی جگہ پر کھولتا ہے، اور ڈی این اے پولیمریز گیپ 3′ کو بڑھاتا ہے اور اگلے ڈی این اے اسٹرینڈ کو بدل دیتا ہے۔

ڈی این اے کے بدلے ہوئے سنگل اسٹرینڈز کو پرائمر کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے اور ڈی این اے پولیمریز کے ذریعے ڈبل اسٹرینڈ میں بڑھایا جا سکتا ہے۔یہ عمل مسلسل دہرایا جاتا ہے، تاکہ ہدف کی ترتیب کو مؤثر طریقے سے بڑھایا جائے۔

نیوکلک ایسڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی 3

اسٹرینڈ ڈسپلیسمنٹ ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی کے فوائد اور نقصانات

SDA کے فوائد:

امپلیفیکیشن کی کارکردگی زیادہ ہے، رد عمل کا وقت مختصر ہے، خاصیت مضبوط ہے، اور کسی خاص سامان کی ضرورت نہیں ہے۔

SDA کی خامیاں:

مصنوعات یکساں نہیں ہیں، اور SDA سائیکل میں کچھ سنگل اسٹرینڈڈ اور ڈبل اسٹرینڈڈ پروڈکٹس ہمیشہ تیار کیے جاتے ہیں، اور الیکٹروفورسس کے ذریعے پتہ چلنے پر ٹیلنگ لامحالہ واقع ہوگی۔

Rolling دائرے پروردن

رولنگ سرکل ایمپلیفیکیشن (آر سی اے) کی تجویز پیتھوجینک جانداروں سے ڈی این اے کو رولنگ سرکل کے ذریعے نقل کرنے کے طریقہ کار پر ڈرائنگ کے ذریعے پیش کی گئی ہے۔یہ ایک مستقل درجہ حرارت پر ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر سنگل پھنسے ہوئے سرکلر ڈی این اے کے استعمال سے مراد ہے، اور ایک خاص ڈی این اے پولیمریز (جیسے Phi29) ) ٹارگٹ جین کی پرورش حاصل کرنے کے لیے رولنگ سرکل ڈی این اے ترکیب کی کارروائی کے تحت۔

آر سی اے کو لکیری امپلیفیکیشن اور ایکسپونیشنل ایمپلیفیکیشن میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔لکیری آر سی اے کی کارکردگی 10 تک پہنچ سکتی ہے۔5اوقات، اور ایکسپونینشل RCA کی کارکردگی 10 تک پہنچ سکتی ہے۔9اوقات

سادہ تفریق، جیسا کہ نیچے دی گئی تصویر میں دکھایا گیا ہے، لکیری امپلیفیکیشن a صرف 1 پرائمر استعمال کرتا ہے، ایکسپونیشنل ایمپلیفیکیشن b میں 2 پرائمر ہیں۔

نیوکلک ایسڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی4

لکیری آر سی اے کو سنگل پرائمر آر سی اے بھی کہا جاتا ہے۔ایک پرائمر سرکلر ڈی این اے سے منسلک ہوتا ہے اور ڈی این اے پولیمریز کے عمل سے اس کی توسیع ہوتی ہے۔پروڈکٹ ایک لکیری سنگل اسٹرینڈ ہے جس میں ایک ہی لوپ کی لمبائی سے ہزاروں گنا بار بار دہرائے جانے والے سلسلے ہیں۔

چونکہ لکیری آر سی اے کا پروڈکٹ ہمیشہ ابتدائی پرائمر سے منسلک ہوتا ہے، اس لیے سگنل کا آسان فکسشن ایک بڑا فائدہ ہے۔

ایکسپونینشل RCA، جسے ہائپر برانچڈ ایمپلیفیکیشن HRCA (ہائپر برانچڈ RCA) کے نام سے بھی جانا جاتا ہے، ایکسپونینشل RCA میں، ایک پرائمر RCA پروڈکٹ کو بڑھاتا ہے، دوسرا پرائمر RCA پروڈکٹ کے ساتھ ہائبرڈائز کرتا ہے اور توسیع کرتا ہے، اور متبادل پہلے سے ہی RCA پروڈکٹ کا پابند ہے، نیچے کی طرف پرائمر اسٹرینڈ کو بڑھاتے ہیں، اور RCA پراڈکٹ کو ریپلیٹ کرنے کے لیے ایکسپونینشل امپلیفیکیشن کو بڑھاتے ہیں۔

نیوکلک ایسڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی5

رولنگ سرکل نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن کے فوائد اور نقصانات

RCA کے فوائد:

اعلی سنویدنشیلتا، اچھی خاصیت اور آسان آپریشن.

آر سی اے کی خامیاں:

سگنل کا پتہ لگانے کے دوران پس منظر کے مسائل۔آر سی اے کے رد عمل کے دوران، غیر گردش شدہ پیڈ لاک پروب اور ان باؤنڈ پروب کا ٹیمپلیٹ DNA یا RNA کچھ بیک گراؤنڈ سگنلز پیدا کر سکتا ہے۔ 

Nucleicacid تسلسل پر مبنی امپلیفیکیشن

نیوکلک ایسڈ سیکوینس بیسڈ ایمپلیفیکیشن (NASBA) PCR کی بنیاد پر تیار کی گئی ایک نئی ٹیکنالوجی ہے۔یہ ایک مسلسل اور isothermal نیوکلک ایسڈ امپلیفیکیشن ہے جس کی رہنمائی T7 پروموٹر کی ترتیب کے ساتھ پرائمر کے ایک جوڑے کے ذریعے کی جاتی ہے۔یہ ٹیکنالوجی ٹیمپلیٹ RNA کو تقریباً 2 گھنٹے میں 109 گنا بڑھا سکتی ہے، جو کہ روایتی PCR طریقہ سے 1000 گنا زیادہ ہے اور اس کے لیے خصوصی آلات کی ضرورت نہیں ہے۔

اس ٹیکنالوجی کو ظاہر ہوتے ہی بیماریوں کی تیزی سے تشخیص کے لیے استعمال کیا گیا ہے اور اس وقت بہت سی کمپنیاں یہ طریقہ RNA ڈیٹیکشن کٹس میں استعمال کرتی ہیں۔

اگرچہ RNA ایمپلیفیکیشن ریورس ٹرانسکرپشن PCR ٹیکنالوجی کا بھی استعمال کر سکتی ہے، NASBA کے اپنے فوائد ہیں: یہ نسبتاً مستقل درجہ حرارت کے حالات میں انجام پا سکتا ہے، اور یہ روایتی PCR ٹیکنالوجی سے زیادہ مستحکم اور درست ہے۔

رد عمل 41 ڈگری سیلسیس پر ہوتا ہے اور اسے مکمل کرنے کے لیے AMV (avian myeloblastosis virus) ریورس ٹرانسکرپٹیس، RNase H، T7 RNA پولیمریز اور پرائمر کا ایک جوڑا درکار ہوتا ہے۔

عمل میں بنیادی طور پر شامل ہیں:

فارورڈ پرائمر T7 پروموٹر کی تکمیلی ترتیب پر مشتمل ہے۔رد عمل کے دوران، فارورڈ پرائمر آر این اے اسٹرینڈ سے جڑ جاتا ہے اور AMV انزائم کے ذریعے اتپریرک ہو کر DNA-RNA ڈبل اسٹرینڈ بناتا ہے۔

RNase H RNA کو ہائبرڈ ڈبل اسٹرینڈ میں ہضم کرتا ہے اور واحد پھنسے ہوئے DNA کو برقرار رکھتا ہے۔

ریورس پرائمر اور AMV انزائم کی کارروائی کے تحت، T7 پروموٹر کی ترتیب پر مشتمل DNA ڈبل اسٹرینڈ بنتا ہے۔

T7 RNA پولیمریز کی کارروائی کے تحت، نقل کا عمل مکمل ہو جاتا ہے اور ہدف RNA کی ایک بڑی مقدار تیار ہوتی ہے۔

نیوکلک ایسڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی6

NASBA کے فوائد:

(1) اس کے پرائمر میں T7 پروموٹر کی ترتیب ہے، لیکن غیر ملکی ڈبل پھنسے ہوئے DNA میں T7 پروموٹر کی کوئی ترتیب نہیں ہے اور اسے بڑھایا نہیں جا سکتا، اس لیے اس ٹیکنالوجی میں اعلیٰ خصوصیت اور حساسیت ہے۔

(2) NASBA الٹ ٹرانسکرپشن کے عمل کو ایمپلیفیکیشن ری ایکشن میں براہ راست شامل کرتا ہے، رد عمل کا وقت کم کرتا ہے۔

NASBA کے نقصانات:

(1) ردعمل کے اجزاء زیادہ پیچیدہ ہیں۔

(2) ردعمل کی لاگت کو زیادہ بنانے کے لیے تین قسم کے انزائمز کی ضرورت ہوتی ہے۔


پوسٹ ٹائم: اگست 06-2021