1. RNA محلول کے جذب کا پتہ لگائیں۔

280، 320، 230، اور 260 nm پر جذب بالترتیب نیوکلک ایسڈ، پس منظر (حل کی خرابی)، نمک کا ارتکاز، اور نامیاتی مادے جیسے پروٹین کی قدروں کی نمائندگی کرتا ہے۔عام طور پر صرف OD260/OD280 (تناسب، R) کو دیکھیں۔جب 1.8~2.0، ہم سوچتے ہیں کہ RNA میں پروٹین یا دیگر نامیاتی مادے کی آلودگی کو برداشت کیا جا سکتا ہے، لیکن یہ خیال رہے کہ جب Tris کو جذب کا پتہ لگانے کے لیے بفر کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، تو R کی قدر 2 سے زیادہ ہو سکتی ہے (عام طور پر اسے <2.2 ہونا چاہیے)۔جب R <1.8، محلول میں پروٹین یا دیگر نامیاتی مادے کی آلودگی زیادہ واضح ہوتی ہے، اور RNA کی تقدیر کا تعین ضروریات کے مطابق کیا جا سکتا ہے۔جب R> 2.2، اس کا مطلب ہے کہ RNA کو واحد نیوکلک ایسڈ میں ہائیڈولائز کیا گیا ہے۔
 
2. RNA کا الیکٹروفوریٹک پیٹرن
عام طور پر، ڈینیچرنگ جیل کو آر این اے الیکٹروفورسس کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، لیکن اگر یہ صرف آر این اے کے معیار کا پتہ لگانے کے لیے ہے، تو ڈینیچرنگ جیل ضروری نہیں ہے، اور عام ایگروز جیل کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔الیکٹروفورسس کا مقصد 28S اور 18S بینڈز کی سالمیت اور ان کے تناسب، یا mRNA سمیر کی سالمیت کا پتہ لگانا ہے۔عام طور پر، اگر 28S اور 18S بینڈ روشن، صاف اور تیز ہیں (بینڈز کے کنارے واضح ہیں) اور 28S کی چمک 18S بینڈ سے دو گنا زیادہ ہے، تو ہم RNA کے معیار کو اچھا سمجھتے ہیں۔
مندرجہ بالا دو طریقے ہیں جو ہم عام طور پر استعمال کرتے ہیں، لیکن ان دونوں طریقوں میں سے کوئی بھی ہمیں واضح طور پر نہیں بتا سکتا کہ آیا RNA محلول میں بقایا RNase موجود ہے۔اگر محلول میں RNase کی بہت کم مقدار موجود ہو تو ہمارے لیے مندرجہ بالا طریقہ سے اس کا پتہ لگانا مشکل ہے، لیکن اس کے بعد ہونے والے زیادہ تر انزیمیٹک ری ایکشن 37 ڈگری سے اوپر اور طویل عرصے تک ہوتے ہیں۔اس طرح اگر RNA محلول میں RNase کی بہت قلیل مقدار موجود ہو تو اس کے بعد کے تجربات میں اپنا کردار ادا کرنے کے لیے بہت موزوں ماحول اور وقت ہو گا اور یقیناً اس وقت تجربہ سرد ہو گا۔ذیل میں ہم ایک طریقہ متعارف کراتے ہیں جو اس بات کی تصدیق کر سکتا ہے کہ آیا RNA محلول میں بقایا RNase موجود ہے۔
 
3. حرارت کے تحفظ کا ٹیسٹ
نمونے کے ارتکاز کے مطابق، RNA محلول سے دو 1000 ng RNA کھینچیں اور اسے 0.5 ملی لیٹر سینٹری فیوج ٹیوب میں شامل کریں، اور اسے pH 7.0 Tris بفر کے ساتھ 10 ul کے کل حجم میں شامل کریں، اور پھر ٹیوب کی ٹوپی کو سیل کریں۔ان میں سے ایک کو 70 ڈگری سینٹی گریڈ پر مستقل درجہ حرارت والے پانی کے غسل میں ڈالیں اور اسے 1 گھنٹے تک گرم رکھیں۔دوسرے حصے کو -20 ° C ریفریجریٹر میں 1 گھنٹے کے لیے محفوظ کیا گیا تھا۔جب وقت ختم ہو جائے تو الیکٹروفورسس کے لیے دو نمونے نکال دیں۔الیکٹروفورسس مکمل ہونے کے بعد، دونوں کے الیکٹروفوریٹک بینڈ کا موازنہ کریں۔اگر دونوں کے بینڈ ایک جیسے ہیں یا ان میں کوئی خاص فرق نہیں ہے (یقیناً، ان کے بینڈ بھی طریقہ 2 کی شرائط پر پورا اترتے ہیں)، تو اس کا مطلب ہے کہ RNA محلول میں RNase کی کوئی بقایا آلودگی نہیں ہے، اور RNA کا معیار بہت اچھا ہے۔اس کے برعکس، اگر 70 ° C پر انکیوبیٹ شدہ نمونہ واضح انحطاط کو ظاہر کرتا ہے، تو یہ ظاہر کرتا ہے کہ RNA محلول میں RNase آلودگی ہے۔
 
2 آر این اے نکالنے کے تجرباتی طریقے اور تکنیک
RNA نکالتے وقت ہمیں اکثر جن مسائل کا سامنا کرنا پڑتا ہے وہ یہ ہیں: (1) RNA کی پیداوار کم ہے۔(2) آر این اے میں نمک کی سنگین آلودگی ہے۔(3) آر این اے میں سنگین نامیاتی سالوینٹ آلودگی ہے۔(4) نمونہ انحطاط اور دیگر مسائل
 
1. عام طور پر استعمال ہونے والے کل RNA نکالنے والے ریجنٹس
guanidine isothiocyanate طریقہ اور Trizol طریقہ جانوروں کے بافتوں اور جانوروں کے خلیوں سے کل RNA نکالنے کے لیے سب سے زیادہ استعمال ہونے والے طریقے ہیں۔یہ خاص طور پر چھوٹے نمونوں اور بافتوں کے لیے موزوں ہے جنہیں نکالنا خاص طور پر مشکل ہے، جیسے کہ خرگوش کی جلد اور جانوروں کے مربوط بافتوں سے کل RNA نکالنا؛اس کے علاوہ، Trizol، ایک عام مقصد کے lysis reagent کے طور پر، پودوں کے ٹشوز، بیکٹیریا، فنگس اور دیگر بافتوں کو نکالنے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔پولی سیکرائڈز اور پولی فینول پر مشتمل پودوں کے بافتوں کے لیے، جیسے کیمیلیا اولیفیرا، چائے کی پتی، ریپسیڈ وغیرہ، CTAB طریقہ کل RNA نکالنے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔

ایک روایتی طریقہ کے طور پر، ڈبل کالم کا طریقہ اس کے عام درجہ حرارت کے آپریشن کی وجہ سے بھی بہت مقبول ہے، RNase کو شامل کرنے کی ضرورت نہیں، اور حفاظت - نکالنے کے لیے کلوروفارم، فینول اور دیگر نامیاتی ریجنٹس نہیں ہیں۔(تجویز کردہ مصنوعات )