• فیس بک
  • لنکڈ
  • یوٹیوب

سالماتی تشخیص کی ٹیکنالوجی انسانی جسم کے جینیاتی مواد اور مختلف پیتھوجینز کے اظہار اور ساخت کا پتہ لگانے کے لیے مالیکیولر بائیولوجی کے طریقوں کا استعمال کرتی ہے، تاکہ بیماریوں کی پیشین گوئی اور تشخیص کا مقصد حاصل کیا جا سکے۔

حالیہ برسوں میں، مالیکیولر تشخیصی ٹیکنالوجی کی اپ گریڈنگ اور تکرار کے ساتھ، مالیکیولر تشخیص کا طبی اطلاق زیادہ سے زیادہ وسیع اور گہرائی میں ہو گیا ہے، اور مالیکیولر تشخیصی مارکیٹ تیزی سے ترقی کے دور میں داخل ہو گئی ہے۔

مصنف نے مارکیٹ میں عام مالیکیولر تشخیصی ٹیکنالوجیز کا خلاصہ کیا ہے، اور اسے تین حصوں میں تقسیم کیا گیا ہے: پہلا حصہ پی سی آر ٹیکنالوجی کو متعارف کراتا ہے، دوسرا حصہ نیوکلک ایسڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی کو متعارف کراتا ہے، اور دوسرا حصہ ترتیب دینے والی ٹیکنالوجی کو متعارف کراتا ہے۔

01

حصہ اول: پی سی آر ٹیکنالوجی

پی سی آر ٹیکنالوجی

پی سی آر (پولیمریز چین ری ایکشن) ان وٹرو ڈی این اے ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجیز میں سے ایک ہے، جس کی تاریخ 30 سال سے زیادہ ہے۔

پی سی آر ٹیکنالوجی کا آغاز 1983 میں سیٹس، USA کے کیری ملس نے کیا۔ملس نے 1985 میں پی سی آر پیٹنٹ کے لیے درخواست دی اور اسی سال سائنس پر پہلا پی سی آر اکیڈمک پیپر شائع کیا۔ملیس نے 1993 میں کیمسٹری کا نوبل انعام جیتا تھا۔

پی سی آر کے بنیادی اصول

پی سی آر ہدف ڈی این اے کے ٹکڑوں کو دس لاکھ سے زیادہ گنا بڑھا سکتا ہے۔اصول یہ ہے کہ ڈی این اے پولیمریز کے کیٹالیسس کے تحت، پیرنٹ اسٹرینڈ ڈی این اے کو ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور ایک مخصوص پرائمر کو توسیع کے نقطہ آغاز کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔اسے وٹرو میں ڈینیچریشن، اینیلنگ اور ایکسٹینشن جیسے مراحل کے ذریعے نقل کیا جاتا ہے۔بیٹی اسٹرینڈ ڈی این اے کا عمل پیرنٹ اسٹرینڈ ٹیمپلیٹ ڈی این اے کی تکمیل کرتا ہے۔

1

معیاری پی سی آر عمل کو تین مراحل میں تقسیم کیا گیا ہے:

1. ڈینیچریشن: ڈی این اے ڈبل اسٹرینڈ کو الگ کرنے کے لیے اعلی درجہ حرارت کا استعمال کریں۔ڈی این اے ڈبل اسٹرینڈ کے درمیان ہائیڈروجن بانڈز زیادہ درجہ حرارت (93-98 ° C) پر ٹوٹ جاتے ہیں۔

2. اینیلنگ: دوہری پھنسے ہوئے ڈی این اے کو الگ کرنے کے بعد، درجہ حرارت کو کم کیا جاتا ہے تاکہ پرائمر واحد پھنسے ہوئے ڈی این اے سے منسلک ہو سکے۔

3. توسیع: درجہ حرارت کم ہونے پر ڈی این اے پولیمریز پابند پرائمر سے ڈی این اے اسٹرینڈ کے ساتھ تکمیلی تاروں کی ترکیب کرنا شروع کر دیتا ہے۔جب توسیع مکمل ہوجاتی ہے، ایک سائیکل مکمل ہوجاتا ہے، اور ڈی این اے کے ٹکڑوں کی تعداد دوگنی ہوجاتی ہے۔

ان تینوں مراحل کو 25-35 بار بدلنے سے، ڈی این اے کے ٹکڑوں کی تعداد میں تیزی سے اضافہ ہوگا۔

2

پی سی آر کی آسانی یہ ہے کہ مختلف ٹارگٹ جینز کے لیے مختلف پرائمر ڈیزائن کیے جا سکتے ہیں، تاکہ ٹارگٹ جین کے ٹکڑوں کو مختصر وقت میں بڑھایا جا سکے۔

اب تک، پی سی آر کو تین قسموں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے، یعنی عام پی سی آر، فلوروسینٹ مقداری پی سی آر اور ڈیجیٹل پی سی آر۔

عام پی سی آر کی پہلی نسل

ٹارگٹ جین کو بڑھانے کے لیے ایک عام پی سی آر ایمپلیفیکیشن انسٹرومنٹ کا استعمال کریں، اور پھر پروڈکٹ کا پتہ لگانے کے لیے ایگروز جیل الیکٹروفورسس استعمال کریں، صرف کوالٹیٹیو تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔

پہلی نسل کے پی سی آر کے اہم نقصانات:

-غیر مخصوص پروردن اور غلط مثبت نتائج کا شکار۔

پتہ لگانے میں کافی وقت لگتا ہے اور آپریشن بوجھل ہوتا ہے۔

-صرف معیار کی جانچ کی جا سکتی ہے۔

دوسری نسل کا فلوروسینس مقداری پی سی آر

فلوروسینس کوانٹیٹیو پی سی آر (ریئل ٹائم پی سی آر)، جسے کیو پی سی آر بھی کہا جاتا ہے، فلوروسینٹ پروبس کو شامل کرکے فلوروسینٹ سگنلز کے جمع ہونے کے ذریعے ایمپلیفائیڈ پروڈکٹس کے جمع ہونے کی نگرانی کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے جو ری ایکشن سسٹم کی پیشرفت کی نشاندہی کر سکتے ہیں، اور فلوروسینس وکر کے ذریعے نتائج کا فیصلہ کرنے کے لیے، اور یہ معیاری CV کی قدر کی مدد سے ہو سکتا ہے۔

چونکہ qPCR ٹیکنالوجی کو بند نظام میں انجام دیا جاتا ہے، اس لیے آلودگی کا امکان کم ہو جاتا ہے، اور مقداری پتہ لگانے کے لیے فلوروسینس سگنل کی نگرانی کی جا سکتی ہے، اس لیے یہ کلینیکل پریکٹس میں سب سے زیادہ استعمال ہوتی ہے اور PCR میں غالب ٹیکنالوجی بن گئی ہے۔

ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری PCR میں استعمال ہونے والے فلوروسینٹ مادوں کو اس میں تقسیم کیا جا سکتا ہے: TaqMan فلوروسینٹ پروبس، مالیکیولر بیکنز اور فلوروسینٹ رنگ۔

1) تقمان فلوروسینٹ تحقیقات:

پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے دوران، پرائمر کا ایک جوڑا شامل کرتے ہوئے ایک مخصوص فلوروسینٹ پروب شامل کی جاتی ہے۔تحقیقات ایک اولیگونوکلیوٹائڈ ہے، اور دونوں سروں پر بالترتیب ایک رپورٹر فلوروسینٹ گروپ اور بجھانے والا فلوروسینٹ گروپ کا لیبل لگا ہوا ہے۔

جب تحقیقات برقرار ہوتی ہے تو، رپورٹر گروپ کی طرف سے خارج ہونے والے فلوروسینٹ سگنل کو بجھانے والے گروپ کے ذریعے جذب کیا جاتا ہے۔پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے دوران، Taq انزائم کی 5′-3′ exonuclease سرگرمی تحقیقات کو ختم کر دیتی ہے، جس سے رپورٹر فلوروسینٹ گروپ اور بجھانے والا فلوروسینٹ گروپ کو الگ کر دیا جاتا ہے، تاکہ فلوروسینس مانیٹرنگ سسٹم فلوروسینس سگنل حاصل کر سکے، یعنی، ہر بار ایک ڈی این اے کی شکل میں ایک فلو اور فلو کی شکل ہوتی ہے۔ فلوروسینس سگنل کا جمع ہونا پی سی آر پروڈکٹ کی تشکیل کے ساتھ مکمل طور پر ہم آہنگ ہوتا ہے۔

2) SYBR فلوروسینٹ رنگ:

پی سی آر ری ایکشن سسٹم میں، ایس وائی بی آر فلوروسینٹ ڈائی کی زیادتی شامل کی جاتی ہے۔SYBR فلوروسینٹ ڈائی کے غیر خاص طور پر DNA ڈبل اسٹرینڈ میں شامل ہونے کے بعد، یہ فلوروسینٹ سگنل خارج کرتا ہے۔SYBR ڈائی مالیکیول جو زنجیر میں شامل نہیں ہے وہ کسی فلوروسینٹ سگنل کو خارج نہیں کرے گا، اس طرح فلوروسینٹ سگنل کو یقینی بناتا ہے PCR مصنوعات میں اضافہ PCR مصنوعات میں اضافے کے ساتھ مکمل طور پر مطابقت رکھتا ہے۔SYBR صرف دوہرے پھنسے ہوئے DNA سے منسلک ہوتا ہے، اس لیے پگھلنے کی وکر کا استعمال اس بات کا تعین کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے کہ آیا PCR ردعمل مخصوص ہے۔

3 4

3) مالیکیولر بیکنز

یہ ایک اسٹیم لوپ ڈبل لیبل والا اولیگونوکلیوٹائڈ پروب ہے جو 5 اور 3 سروں پر تقریباً 8 بیسز کا ہیئرپین کا ڈھانچہ بناتا ہے۔دونوں سروں پر نیوکلک ایسڈ کی ترتیب مکمل طور پر جوڑ دی جاتی ہے، جس کی وجہ سے فلوروسینٹ گروپ اور بجھانے والا گروپ تنگ ہوتا ہے۔بند کریں، یہ فلوروسینس پیدا نہیں کرے گا.

5

پی سی آر پروڈکٹ تیار ہونے کے بعد، اینیلنگ کے عمل کے دوران، مالیکیولر بیکن کے درمیانی حصے کو ایک مخصوص ڈی این اے ترتیب کے ساتھ جوڑا جاتا ہے، اور فلوروسینٹ جین کو مائدیپتی پیدا کرنے کے لیے بجھانے والے جین سے الگ کیا جاتا ہے۔

6

دوسری نسل کے پی سی آر کے اہم نقصانات:

حساسیت کا ابھی بھی فقدان ہے، اور کم نقل والے نمونوں کا پتہ لگانا درست نہیں ہے۔

پس منظر کی قدر کا اثر ہے، اور نتیجہ مداخلت کے لیے حساس ہے۔

تیسری نسل ڈیجیٹل پی سی آر

ڈیجیٹل پی سی آر (ڈیجیٹل پی سی آر، ڈی پی سی آر، ڈی آئی جی پی سی آر) اختتامی نقطہ کا پتہ لگانے کے ذریعے ہدف کی ترتیب کے کاپی نمبر کا حساب لگاتا ہے، اور اندرونی کنٹرول اور معیاری منحنی خطوط کا استعمال کیے بغیر درست مطلق مقداری پتہ لگا سکتا ہے۔

ڈیجیٹل پی سی آر اینڈ پوائنٹ کا پتہ لگانے کا استعمال کرتا ہے اور سی ٹی ویلیو (سائیکل تھریشولڈ) پر انحصار نہیں کرتا ہے، لہذا ڈیجیٹل پی سی آر رد عمل ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی سے کم متاثر ہوتا ہے، اور اعلی درستگی اور تولیدی صلاحیت کے ساتھ، پی سی آر ردعمل روکنے والوں کے لیے رواداری بہتر ہوتی ہے۔

اعلیٰ حساسیت اور اعلیٰ درستگی کی خصوصیات کی وجہ سے، اس میں پی سی آر رد عمل روکنے والے آسانی سے مداخلت نہیں کرتے، اور یہ معیاری مصنوعات کے بغیر حقیقی مطلق مقدار کو حاصل کر سکتا ہے، جو کہ ایک تحقیق اور اطلاق کا مرکز بن چکا ہے۔

ردعمل یونٹ کی مختلف شکلوں کے مطابق، اسے تین اقسام میں تقسیم کیا جا سکتا ہے: مائیکرو فلائیڈک، چپ اور ڈراپلیٹ سسٹم۔


پوسٹ ٹائم: جولائی 08-2021