کیو پی سی آر کے تجربات میں، پرائمر ڈیزائن بھی ایک بہت اہم کڑی ہے۔آیا پرائمر موزوں ہیں یا نہیں اس کا اس بات سے گہرا تعلق ہے کہ آیا ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی معیار تک پہنچتی ہے، آیا ایمپلیفائیڈ مصنوعات مخصوص ہیں، اور آیا تجرباتی نتائج دستیاب ہیں۔
تو کیو پی سی آر پرائمر کی مخصوصیت کو کیسے بہتر بنایا جائے؟اعلی پروردن کی کارکردگی؟
آج، ہم آپ کو ایک ساتھ qPCR پرائمر ڈیزائن کرنے کے لیے لے جائیں گے، اور qPCR پرائمر ڈیزائن کو تجربات میں ایک موثر علمی مہارت بننے دیں گے۔
qPCR پرائمر ڈیزائن کرتے وقت، عام طور پر درج ذیل نکات پر دھیان دیں: پرائمر کو ہر ممکن حد تک انٹرن پر ڈیزائن کیا جانا چاہیے، پراڈکٹ کی لمبائی 100-300 bp ہونی چاہیے، Tm ویلیو 60°C کے جتنا ممکن ہو قریب ہونا چاہیے، اور upstream اور downstream پرائمر جتنا ممکن ہو قریب ہونا چاہیے، اور پرائمر کا اختتام G یا C ہونا چاہیے، وغیرہ انتظار کریں۔
1. انٹرنز پر پھیلے پرائمر کا ڈیزائن
کیو پی سی آر پرائمر کو ڈیزائن کرتے وقت، انٹرونز میں ڈیزائن کیے گئے پرائمر کا انتخاب جی ڈی این اے ٹیمپلیٹ کو ایمپلیفائی ہونے سے روک سکتا ہے، اور پراڈکٹس سبھی سی ڈی این اے کے ایمپلیفیکیشن سے اخذ کیے جاتے ہیں، اس طرح جی ڈی این اے آلودگی کے اثر کو ختم کرتے ہیں۔
2. پرائمر کی لمبائی
پرائمر کی لمبائی عام طور پر 18-30 nt کے درمیان ہوتی ہے، اور ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ کی لمبائی کو جتنا ممکن ہو سکے 100-300 bp کے درمیان کنٹرول کیا جانا چاہیے۔
اگر پرائمر بہت چھوٹا ہے، تو یہ غیر مخصوص پرورش کا باعث بنے گا، اور اگر یہ بہت لمبا ہے، تو یہ آسانی سے ثانوی ڈھانچہ (جیسے ہیئر پین کا ڈھانچہ) بنائے گا۔اگر ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ بہت لمبا ہے، تو یہ پولیمریز کے رد عمل کے لیے موزوں نہیں ہے، جو پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کو متاثر کرے گا۔
3. GC مواد اور Tm قدر
پرائمر کے GC مواد کو 40% اور 60% کے درمیان کنٹرول کیا جانا چاہیے۔اگر یہ بہت زیادہ یا بہت کم ہے، تو یہ رد عمل شروع کرنے کے لیے موزوں نہیں ہے۔ایک ہی Tm قدر اور اینیلنگ درجہ حرارت حاصل کرنے کے لیے فارورڈ اور ریورس پرائمر کا GC مواد ایک ہی کے قریب ہونا چاہیے۔
Tm قدر جہاں تک ممکن ہو 55-65 ° C کے درمیان ہونی چاہئے، عام طور پر 60 ° C کے ارد گرد، اور اوپر اور نیچے کی طرف کی Tm قدر جتنا ممکن ہو قریب ہو، ترجیحاً 4 ° C سے زیادہ نہ ہو۔
4. پرائمر کے 3′ آخر میں A کو منتخب کرنے سے گریز کریں۔
جب پرائمر کا 3′ اختتام مماثل نہیں ہوتا ہے، تو مختلف بنیادوں کی ترکیب کی کارکردگی میں بہت زیادہ فرق ہوتا ہے۔جب آخری بنیاد A ہے، تو یہ مماثلت نہ ہونے کی صورت میں بھی سلسلہ کی ترکیب کو شروع کر سکتا ہے، اور جب آخری بنیاد T when ہو، تو مماثل شمولیت کی کارکردگی بہت کم ہو جاتی ہے۔لہذا، پرائمر کے 3′ آخر میں A کو منتخب کرنے سے گریز کرنے کی کوشش کریں، اور T کا انتخاب کرنا بہتر ہے۔
اگر یہ ایک پروب پرائمر ہے تو، تحقیقات کا 5′ اختتام G نہیں ہو سکتا، کیونکہ یہاں تک کہ جب ایک واحد G بیس FAM فلوروسینٹ رپورٹر گروپ سے منسلک ہوتا ہے، G FAM گروپ کے ذریعے خارج ہونے والے فلوروسینٹ سگنل کو بھی بجھا سکتا ہے، جس کے نتیجے میں غلط منفی نتائج برآمد ہوتے ہیں۔ظاہر ہونا۔
5. بنیادی تقسیم
پرائمر میں چار اڈوں کی تقسیم ترجیحی طور پر بے ترتیب ہے، 3′ کے آخر میں لگاتار 3 سے زیادہ G یا C سے گریز کرنا، اور 3 سے زیادہ لگاتارG یا C کو GC سے بھرپور ترتیب والے خطے میں جوڑا بنانا آسان ہے۔
6. پرائمر ڈیزائن والے علاقے کو پیچیدہ ثانوی ڈھانچے سے بچنا چاہیے۔
ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ کے سنگل اسٹرینڈ سے بننے والا ثانوی ڈھانچہ PCR کی ہموار ترقی کو متاثر کرے گا۔پہلے سے یہ اندازہ لگا کر کہ آیا ہدف کی ترتیب میں کوئی ثانوی ڈھانچہ موجود ہے، پرائمر کے ڈیزائن میں اس خطے سے بچنے کی کوشش کریں۔
7. پرائمر خود اور پرائمر کے درمیان لگاتار تکمیلی اڈوں سے بچنے کی کوشش کریں۔
خود پرائمر اور پرائمر کے درمیان کوئی لگاتار 4 بنیادی تکمیل نہیں ہو سکتی۔پرائمر میں خود ایک تکمیلی ترتیب نہیں ہونی چاہیے، ورنہ یہ خود کو تہہ کرکے بالوں کے پین کا ڈھانچہ بنائے گا، جو پرائمر اور ٹیمپلیٹ کے اینیلنگ امتزاج کو متاثر کرے گا۔
اپ اسٹریم اور ڈاون اسٹریم پرائمر کے درمیان تکمیلی سلسلے موجود نہیں ہوسکتے ہیں۔پرائمر کے درمیان تکمیل پرائمر ڈائمرز پیدا کرے گا، جو پی سی آر کی کارکردگی کو کم کرے گا اور یہاں تک کہ مقداری درستگی کو بھی متاثر کرے گا۔اگر پرائمر-ڈائمر اور ہیئر پین کے ڈھانچے ناگزیر ہیں، تو △G کی قدر بہت زیادہ نہیں ہونی چاہیے (4.5 kcal/mol سے کم ہونی چاہیے)۔
8. پرائمر ہدف مخصوص مصنوعات کو بڑھا دیتے ہیں۔
کیو پی سی آر کا پتہ لگانے کا حتمی مقصد ہدف جین کی کثرت کو سمجھنا ہے۔اگر غیر مخصوص پروردن ہوتا ہے، تو مقدار درست نہیں ہوگی۔لہٰذا، پرائمر کے ڈیزائن ہونے کے بعد، انہیں BLAST کے ذریعے جانچنے کی ضرورت ہے، اور مصنوعات کی خصوصیت کا ترتیب ڈیٹا بیس میں موازنہ کیا جاتا ہے۔
اگلا، ہم انسانی GAS6 (گروتھ گرفتاری مخصوص 6) جین کو qPCR پرائمر ڈیزائن کرنے کے لیے ایک مثال کے طور پر لیتے ہیں۔
01 سوال جین
ہومو GAS6NCBI کے ذریعےیہاں، ہمیں جین کے نام اور پرجاتیوں کا موازنہ کرنے پر توجہ دینی چاہیے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ وہ مطابقت رکھتے ہیں۔
02 جین کی ترتیب تلاش کریں۔
(1) اگر ہدف کی ترتیب جینومک ڈی این اے ہے، تو پہلے کو منتخب کریں، جو کہ جین کا جینومک ڈی این اے ترتیب ہے۔
(2) اگر ہدف کی ترتیب mRNA ہے تو دوسرا منتخب کریں۔داخل ہونے کے بعد، نیچے دیے گئے جدول میں "CDS" پر کلک کریں۔بھورے پس منظر کی ترتیب جین کی کوڈنگ ترتیب ہے۔
03 ڈیزائن پرائمر
پرائمر بلاسٹ انٹرفیس درج کریں۔
اوپری بائیں جانب فاسٹا فارمیٹ میں جین کی ترتیب نمبر یا ترتیب درج کریں، اور متعلقہ پیرامیٹرز کو پُر کریں۔

"پرائمر حاصل کریں" پر کلک کریں اور NCBI آپ کو بتانے کے لیے پاپ اپ ہو جائے گا کہ اس طرح کے پیرامیٹر کے انتخاب کو دوسرے الگ کرنے والی مختلف حالتوں میں بڑھا دیا جائے گا۔ہم مختلف الگ الگ قسموں کو چیک کر سکتے ہیں اور مناسب پرائمر جوڑا حاصل کرنے کے لیے انہیں جمع کر سکتے ہیں (جیسا کہ نیچے دی گئی تصویر میں دکھایا گیا ہے)۔اس عمل کو چلنے میں دسیوں سیکنڈ لگ سکتے ہیں۔
ان پرائمر جوڑوں کا اینیلنگ درجہ حرارت تقریباً 60 ° C ہے۔تجربے کے مقصد کے مطابق، معتدل لمبائی، اچھی خاصیت اور تجربے کے لیے پرائمرز کی کم خود تکمیل کے ساتھ پرائمر کا انتخاب کریں، اور کامیابی کی شرح کافی زیادہ ہے!
04 پرائمر مخصوصیت کی تصدیق
درحقیقت، پرائمر ڈیزائن کرنے کے علاوہ، پرائمر بلاسٹ ان پرائمرز کا بھی جائزہ لے سکتا ہے جنہیں ہم نے خود ڈیزائن کیا ہے۔پرائمر ڈیزائن صفحہ پر واپس جائیں، اپ اسٹریم اور ڈاون اسٹریم پرائمر درج کریں جنہیں ہم نے ڈیزائن کیا ہے، اور دیگر پیرامیٹرز کو ایڈجسٹ نہیں کیا جائے گا۔جمع کرنے کے بعد، آپ دیکھ سکتے ہیں کہ آیا پرائمر کا جوڑا دوسرے جینز پر بھی موجود ہے۔اگر ان سب کو اس جین پر ظاہر کیا جاتا ہے جسے ہم بڑھانا چاہتے ہیں، اس بات کا اشارہ ہے کہ پرائمر کے اس جوڑے کی خاصیت بہت اچھی ہے!(مثال کے طور پر، یہ پرائمر استفسار کا واحد نتیجہ ہے!)

05 پرائمر معیار کا فیصلہ
"پرفیکٹ" پرائمر کس قسم کا پرائمر ہے جو "معیاری تک بڑھانے کی کارکردگی"، "زیادہ سے زیادہ مصنوعات کی خصوصیات"، اور "قابل اعتماد تجرباتی نتائج" کو یکجا کرتا ہے؟
امپلیفیکیشن کی کارکردگی

پگھلنے والی وکر
پرائمر کی ایمپلیفیکیشن افادیت 90%-110% تک پہنچ جاتی ہے، جس کا مطلب ہے کہ ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی اچھی ہے، اور پگھلنے والے وکر کی ایک چوٹی ہے اور عام طور پر Tm>80°C، جس کا مطلب ہے کہ ایمپلیفیکیشن کی خصوصیت اچھی ہے۔
 
متعلقہ مصنوعات:
ریئل ٹائم پی سی آر ایزی – SYBR گرین I
ریئل ٹائم پی سی آر ایزی-تقمان