• فیس بک
  • لنکڈ
  • یوٹیوب

 فلوروسینس مقداری پی سی آر (جسے TaqMan PCR بھی کہا جاتا ہے، بعد میں FQ-PCR کہا جاتا ہے) ایک نئی نیوکلک ایسڈ مقداری ٹیکنالوجی ہے جسے PE (Perkin Elmer) نے 1995 میں ریاستہائے متحدہ میں تیار کیا تھا۔ یہ ٹیکنالوجی روایتی PCR پر فلورسنٹ لیبل لگا کر شامل کر کے بنائی گئی ہے۔لچکدار PCR کے مقابلے میں، FQ-PCR کے اپنے مقداری کام کو محسوس کرنے کے بہت سے فوائد ہیں۔اس مضمون کا مقصد ٹیکنالوجی کی خصوصیات، اصولوں، طریقوں اور استعمال کو مختصراً بیان کرنا ہے۔

1 خصوصیات

FQ-PCR میں نہ صرف عام پی سی آر کی زیادہ حساسیت ہے، بلکہ فلوروسینٹ پروبس کے اطلاق کی وجہ سے، یہ مقداری نتائج حاصل کرنے کے لیے فوٹو الیکٹرک کنڈکشن سسٹم کے ذریعے پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے دوران فلوروسینٹ سگنل کی تبدیلی کا براہ راست پتہ لگا سکتا ہے، جو روایتی پی سی آر کی بہت سی خامیوں کو دور کرتا ہے، اس لیے اس میں ہائی اسپیکٹ ڈی این اے کی مخصوص ٹیکنالوجی اور ڈی این اے کی مخصوص ٹیکنالوجی بھی ہے۔

مثال کے طور پر، عام پی سی آر پروڈکٹس کو ایگروز جیل الیکٹروفورسس اور ایتھیڈیم برومائڈ کے داغ الٹرا وایلیٹ لائٹ یا پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس اور سلور سٹیننگ کے ذریعے دیکھنے کی ضرورت ہے۔اس کے لیے نہ صرف متعدد آلات کی ضرورت ہوتی ہے بلکہ وقت اور محنت بھی درکار ہوتی ہے۔ایتھیڈیم برومائیڈ استعمال کیے جانے والے داغ انسانی جسم کے لیے نقصان دہ ہیں اور یہ پیچیدہ تجرباتی طریقہ کار آلودگی اور جھوٹے مثبت ہونے کے مواقع فراہم کرتے ہیں۔تاہم، FQ-PCR کو نمونے کی لوڈنگ کے دوران صرف ایک بار ڈھکن کھولنے کی ضرورت ہوتی ہے، اور اس کے بعد کا عمل مکمل طور پر بند ٹیوب آپریشن ہوتا ہے، جس میں PCR پوسٹ پروسیسنگ کی ضرورت نہیں ہوتی، روایتی PCR آپریشنز میں بہت سی خرابیوں سے گریز کیا جاتا ہے۔تجربہ عام طور پر PE کمپنی کے تیار کردہ ABI7100 PCR تھرمل سائیکلر کا استعمال کرتا ہے۔

آلے میں درج ذیل خصوصیات ہیں: ① وسیع اطلاق: اسے ڈی این اے اور آر این اے پی سی آر کی مصنوعات کی مقدار، جین کے اظہار کی تحقیق، پیتھوجین کا پتہ لگانے اور پی سی آر کے حالات کی اصلاح کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔② منفرد مقداری اصول: فلوروسینٹ لیبل والی تحقیقات کا استعمال کرتے ہوئے، لیزر ایکسائٹیشن کے بعد فلوروسینس کی مقدار PCR سائیکل کے ساتھ جمع ہو جائے گی، تاکہ مقدار کا مقصد حاصل کیا جا سکے۔③ اعلی کام کرنے کی کارکردگی: بلٹ ان 9600 پی سی آر تھرمل سائیکلر، کمپیوٹر 1 سے 2 گھنٹے تک کنٹرول کرتا ہے تاکہ 96 نمونوں کو خود بخود اور ہم وقت سازی سے مکمل کیا جا سکے۔④ جیل الیکٹروفورسس کی ضرورت نہیں: نمونے کو پتلا کرنے اور الیکٹروفورسس کرنے کی ضرورت نہیں ہے، صرف ردعمل ٹیوب میں براہ راست پتہ لگانے کے لیے ایک خصوصی تحقیقات کا استعمال کریں۔⑤پائپ لائن میں کوئی آلودگی نہیں: منفرد مکمل طور پر بند ری ایکشن ٹیوب اور فوٹو الیکٹرک ترسیل کا نظام اپنایا گیا ہے، اس لیے آلودگی کے بارے میں فکر کرنے کی ضرورت نہیں ہے۔⑥نتائج دوبارہ پیدا کرنے کے قابل ہیں: مقداری متحرک رینج شدت کے پانچ آرڈرز تک ہے۔لہذا، چونکہ اس ٹیکنالوجی کو کامیابی کے ساتھ تیار کیا گیا ہے، بہت سے سائنسی محققین نے اس کی قدر کی ہے اور بہت سے شعبوں میں اس کا اطلاق کیا گیا ہے۔

2 اصول اور طریقے

FQ-PCR کا عملی اصول پی سی آر ری ایکشن سسٹم میں فلوروسینٹلی لیبل والی تحقیقات کو شامل کرنے کے لیے Taq انزائم کی 5′→3′ exonuclease سرگرمی کا استعمال کرنا ہے۔تحقیقات خاص طور پر پرائمر ترتیب میں موجود ڈی این اے ٹیمپلیٹ کے ساتھ ہائبرڈائز کر سکتی ہیں۔تحقیقات کے 5′سرے پر فلوروسینس ایمیشن جین FAM (6-carboxyfluorescein، 518nm پر فلوروسینس اخراج کی چوٹی) کا لیبل لگا ہوا ہے، اور 3′اختتام پر The fluorescence quenching Group TAMRA (6-carboxytramethylrhodence)، 6-carboxyetramethylrhodence، 5′ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے دوران تحقیقات کو بڑھانے سے روکنے کے لیے تحقیقات کا آغاز فاسفوریلیٹ کیا جاتا ہے۔جب تحقیقات برقرار رہتی ہے تو، بجھانے والا گروپ خارج کرنے والے گروپ کے فلوروسینس اخراج کو دباتا ہے۔ایک بار جب خارج کرنے والے گروپ کو بجھانے والے گروپ سے الگ کر دیا جاتا ہے، تو روک تھام کو اٹھا لیا جاتا ہے، اور 518nm پر نظری کثافت بڑھ جاتی ہے اور اس کا پتہ فلوروسینس ڈٹیکشن سسٹم کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ بحالی کے مرحلے میں، جانچ ٹیمپلیٹ DNA کے ساتھ ہائبرڈائز ہوتی ہے، اور Taq انزائم DNA کے ایکسٹینشن کے ساتھ ایکسٹینشن کے مرحلے میں ڈی این اے کے ساتھ ہائبرڈائز ہوتا ہے۔جب تحقیقات کاٹ دی جاتی ہے تو، بجھانے کا اثر جاری ہوتا ہے اور فلوروسینٹ سگنل جاری ہوتا ہے۔جب بھی ٹیمپلیٹ کو کاپی کیا جاتا ہے، ایک تحقیقات کو کاٹ دیا جاتا ہے، اس کے ساتھ فلوروسینٹ سگنل جاری ہوتا ہے۔چونکہ جاری شدہ فلوروفورس کی تعداد اور پی سی آر مصنوعات کی تعداد کے درمیان ایک سے ایک تعلق ہے، اس تکنیک کو ٹیمپلیٹ کی درست مقدار کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔تجرباتی آلہ عام طور پر PE کمپنی کے تیار کردہ ABI7100 PCR تھرمل سائیکلر کا استعمال کرتا ہے، اور دیگر تھرمل سائیکلرز کو بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔اگر تجربے کے لیے ABI7700 ری ایکشن ٹائپ ری ایکشن سسٹم استعمال کیا جاتا ہے، تو ری ایکشن مکمل ہونے کے بعد، مقداری نتائج براہ راست کمپیوٹر کے تجزیے کے ذریعے دیے جا سکتے ہیں۔اگر آپ دوسرے تھرمل سائیکلر استعمال کرتے ہیں، تو آپ کو RQ+, RQ-، △RQ کا حساب لگانے کے لیے ایک ہی وقت میں ری ایکشن ٹیوب میں فلوروسینس سگنل کی پیمائش کرنے کے لیے فلوروسینس ڈیٹیکٹر استعمال کرنے کی ضرورت ہے۔RQ+ نمونے کی ٹیوب کے فلوروسینٹ اخراج گروپ کی چمکیلی اخراج کی شدت کے تناسب کو بجھانے والے گروپ کی luminescence شدت کے تناسب کی نمائندگی کرتا ہے، RQ- خالی ٹیوب میں دونوں کے تناسب کی نمائندگی کرتا ہے، △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) نمائندگی کرتا ہے PCR کے بعد فلو کے عمل کے دوران اعداد و شمار میں تبدیلی کی علامت کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے۔ .فلوروسینٹ پروبس کے متعارف ہونے کی وجہ سے، تجربے کی خصوصیت میں نمایاں بہتری آئی ہے۔تحقیقات کے ڈیزائن کو عام طور پر درج ذیل شرائط کو پورا کرنا چاہیے: ①تحقیقات کی لمبائی تقریباً 20-40 بیسز ہونی چاہیے تاکہ بائنڈنگ کی خصوصیت کو یقینی بنایا جا سکے۔②جی سی بیسز کا مواد 40% اور 60% کے درمیان ہے تاکہ سنگل نیوکلیوٹائڈ سیکوینسز کی نقل سے بچا جا سکے۔③ ہائبرڈائزیشن سے بچیں یا پرائمر کے ساتھ اوورلیپ کریں۔④ پروب اور ٹیمپلیٹ کے درمیان بائنڈنگ کا استحکام پرائمر اور ٹیمپلیٹ کے درمیان بائنڈنگ کے استحکام سے زیادہ ہے، اس لیے پروب کی Tm ویلیو پرائمر کی Tm قدر سے کم از کم 5°C زیادہ ہونی چاہیے۔اس کے علاوہ، تحقیقات کا ارتکاز، تحقیقات اور ٹیمپلیٹ کی ترتیب کے درمیان ہم آہنگی، اور تحقیقات اور پرائمر کے درمیان فاصلہ سبھی تجرباتی نتائج پر اثر انداز ہوتے ہیں۔

متعلقہ مصنوعات:

چائنا Lnc-RT Heroᵀᴹ I(gDNase کے ساتھ)(lncRNA سے فرسٹ اسٹرینڈ cDNA ترکیب کے لیے سپر پریمکس) مینوفیکچرر اور سپلائر |فارجین (foreivd.com)

چین ریئل ٹائم پی سی آر Easyᵀᴹ-تقمان مینوفیکچرر اور سپلائر |فارجین (foreivd.com)


پوسٹ ٹائم: اکتوبر 15-2021