ڈائریکٹ پی سی آر ایک ایسا ردعمل ہے جو نیوکلک ایسڈ نکالے بغیر پرورش کے لیے جانوروں یا پودوں کے ٹشوز کو براہ راست استعمال کرتا ہے۔بہت سے طریقوں سے، براہ راست پی سی آر باقاعدہ پی سی آر کی طرح کام کرتا ہے۔

بنیادی فرق براہ راست پی سی آر میں استعمال ہونے والا کسٹم بفر ہے، نمونے کو نیوکلک ایسڈ نکالے بغیر براہ راست پی سی آر کے رد عمل کا نشانہ بنایا جا سکتا ہے، لیکن انزائمز کی رواداری اور براہ راست پی سی آر ردعمل میں شامل بفر کی مطابقت کے لیے متعلقہ تقاضے ہیں۔

اگرچہ عام نمونوں میں کم و بیش پی سی آر روکنے والے ہوتے ہیں، پھر بھی براہ راست پی سی آر انزائمز اور بفرز کی کارروائی کے تحت قابل اعتماد امپلیفیکیشن حاصل کر سکتا ہے۔روایتی پی سی آر رد عمل کو ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر اعلیٰ معیار کے نیوکلک ایسڈ کی ضرورت ہوتی ہے، جو پی سی آر کے رد عمل کی ہموار پیش رفت کو روک سکتا ہے اگر ٹیمپلیٹ میں پروٹین اور دیگر نجاستیں ہوں۔ڈائریکٹ پی سی آر اس وقت مالیکیولر ڈائیگنوسٹکس کے میدان میں سب سے زیادہ مقبول ٹیکنالوجیز میں سے ایک ہے۔

01 ڈائریکٹ پی سی آر اصل میں جانوروں اور پودوں کے لیے استعمال ہوتا تھا۔

براہ راست پی سی آر کا ابتدائی اطلاق جانوروں اور پودوں کے میدان میں ہوتا ہے، جیسے چوہے کے خون، بافتوں اور بالوں، بلی، مرغی، خرگوش، بھیڑ، مویشی وغیرہ، پودوں کے پتے اور بیج وغیرہ، جن کا مطالعہ جین ٹائپنگ، ٹرانسجینک، پلاسمڈ کا پتہ لگانے، جین ناک آؤٹ سورس، ڈی این اے آئیڈینٹ تجزیہ، ایس این اے شناختی تجزیہ، ایس این اے کی شناخت کے میدان میں کیا جاتا ہے۔ s

ان شعبوں میں کچھ مشترکہ خصوصیات ہیں، یعنی ہدف جین کا مواد نسبتاً زیادہ ہے اور نیوکلک ایسڈ نکالنا مشکل ہے، اس لیے براہ راست پی سی آر نہ صرف وقت بچا سکتا ہے اور نتائج پر تھوڑا سا اثر ڈال سکتا ہے، بلکہ لاگت کو بھی بچا سکتا ہے۔

پیتھوجین کا پتہ لگانے کے لیے استعمال ہونے والا ڈائریکٹ پی سی آر حالیہ برسوں کی بات ہے، کچھ پی سی آر ریجنٹ مینوفیکچررز نے جدت کرتے وقت اس سمت میں کافی کوششیں کی ہیں۔خاص طور پر اس COVID-19 وبا میں، اس طرح کی بہت سی شناخت کرنے والی مصنوعات مارکیٹ میں نمودار ہوئی ہیں، جیسے کہ SARS-CoV-2 نیوکلک ایسڈ ڈیٹیکشن کٹ (ملٹی پلیکس پی سی آر فلوروسینٹ پروب میتھڈ) جو فارجین کے ذریعے تحقیق اور تیار کی گئی ہے، جو کہ ریئل ٹائم آر ٹی پی سی آر ٹیکنالوجی (rRT-PCR) کا استعمال کرتی ہے۔ oropharyngeal جھاڑو کے نمونے.

فورجین ان کمپنیوں میں سے ایک ہے جو عام ORF1ab، N، E، اور کا پتہ لگانے کے لیے ڈائریکٹ PCR ٹیکنالوجی استعمال کرتی ہے۔متغیر انسانی ناسوفرینجیل یا oropharyngeal جھاڑو کے نمونوں میں نسب نیوکلک ایسڈ جیسے SARS-CoV-2 B.1.1.7 نسب (UK)، B.1.351 نسب (ZA)، B.1.617 نسب (IND) اور P.1 نسب (BR)۔

02  براہ راست پی سی آر کے لیے ریجنٹس کی ضرورت ہے۔

نمونہ Lysate

نمونہ lysate خود کی طرف سے تشکیل یا خریدا جا سکتا ہے.lysate کے مختلف برانڈز کی ساخت میں فرق lysing کی صلاحیت کو مختلف بنا دے گا، اور پھر lysing کا وقت قدرے مختلف ہو گا۔مثال کے طور پر، جانوروں کے بافتوں کے نمونوں کی تیاری کے لیے، عام طور پر 30 منٹ یا راتوں رات lysis کی سفارش کی جاتی ہے، اور وائرس کے لیے lysis کا حل 3-10 منٹ تک ہوتا ہے۔

پی سی آر ماسٹر مکس

مخصوص ایمپلیفیکیشن کو بڑھانے اور ایمپلیفیکیشن کی صلاحیت کو بڑھانے کے لیے ہاٹ اسٹارٹ ڈی این اے پولیمریز استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔براہ راست پی سی آر کا بنیادی حصہ ایک انتہائی برداشت کرنے والا پولیمریز ہے۔

نمونے میں موجود اجزاء کو ختم یا روکنا جو ڈی این اے پروردن کو متاثر کرتے ہیں۔

لیسیٹ کے ساتھ نمونے پر کارروائی کرنے کے بعد، پروٹین، لپڈ اور دیگر سیل ملبے کو جاری کیا جائے گا، یہ مادے پی سی آر کے رد عمل کو روکیں گے۔لہذا، براہ راست پی سی آر کو ان عوامل کے اثر و رسوخ کو کم کرنے کے لیے متعلقہ ہٹانے یا روکنے والے شامل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔

03  براہ راست پی سی آر کے پانچ علمی نکات کا مجموعہ

سب سے پہلے، ڈائریکٹ پی سی آر ٹیکنالوجی مختلف حیاتیاتی نمونوں کے لیے براہ راست پی سی آر ٹیکنالوجی ہے۔اس تکنیکی حالت کے تحت، نیوکلک ایسڈ کو الگ کرنے اور نکالنے کی ضرورت نہیں ہے، براہ راست ٹشو کے نمونے کو بطور آبجیکٹ استعمال کریں، اور PCR کے رد عمل کو انجام دینے کے لیے ٹارگٹ جین پرائمر شامل کریں۔

دوسرا، ڈائریکٹ پی سی آر ٹیکنالوجی نہ صرف ایک روایتی ڈی این اے ٹیمپلیٹ ایمپلیفیکیشن ٹیکنالوجی ہے بلکہ اس میں آر این اے ٹیمپلیٹ ریورس ٹرانسکرپشن پی سی آر بھی شامل ہے۔

تیسرا، ڈائریکٹ پی سی آر ٹیکنالوجی نہ صرف بافتوں کے نمونوں پر معمول کے معیاری پی سی آر رد عمل کو براہ راست انجام دیتی ہے، بلکہ اس میں ریئل ٹائم کیو پی سی آر رد عمل بھی شامل ہیں، جس کے لیے ری ایکشن سسٹم کو مضبوط اینٹی بیک گراؤنڈ فلوروسینس مداخلت کی صلاحیت اور اینڈوجینس فلوروسینس مخالف صلاحیت کو بجھانے کی ضرورت ہوتی ہے۔

چوتھا، ڈائریکٹ پی سی آر ٹیکنالوجی کے ذریعے نشانہ بنائے گئے نمونوں کو صرف نیوکلک ایسڈ ٹیمپلیٹس کے اجراء کی ضرورت ہوتی ہے، اور وہ پروٹین، پولی سیکرائڈز، نمک کے آئنوں وغیرہ کو نہیں ہٹاتے ہیں جو پی سی آر کے رد عمل میں مداخلت کرتے ہیں۔جس کے لیے ری ایکشن سسٹم میں نیوکلک ایسڈ پولیمریز اور پی سی آر مکس کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ پیچیدہ حالات میں انزائم کی سرگرمی اور نقل کی درستگی کو یقینی بنانے کے لیے بہترین مزاحمت اور موافقت ہو۔

پانچویں، بغیر کسی نیوکلک ایسڈ کی افزودگی کے علاج کے ڈائریکٹ پی سی آر ٹیکنالوجی کے ذریعے نشانہ بنایا گیا ٹشو نمونہ اور ٹیمپلیٹ کی مقدار بہت کم ہے، جس کے لیے ری ایکشن سسٹم کو انتہائی حساسیت اور ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کی ضرورت ہوتی ہے۔