• فیس بک
  • لنکڈ
  • یوٹیوب

مجھے یقین ہے کہ پی سی آر ری ایکشن کرتے وقت ہر ایک کو ہمیشہ اس طرح کے مسائل کا سامنا کرنا پڑے گا، لیکن ان میں سے زیادہ تر کو دو اہم مسائل میں تقسیم کیا جا سکتا ہے:

جین ٹیمپلیٹ کی بہت کم پرورش (پروردن)؛
بہت زیادہ غیر ٹارگٹ جین پروردن۔
ان مسائل کو حل کرنے کے لیے additives کا استعمال عام حکمت عملیوں میں سے ایک ہے۔عام طور پر additives کے کردار کے دو پہلو ہوتے ہیں:
ثانوی ڈھانچہجین کی (ثانوی ساخت)؛
غیر مخصوص پرائمنگ کو کم کریں۔
آج، ایڈیٹر مختصر طور پر آپ کو پی سی آر کے رد عمل اور ان کے افعال میں عام اضافے کا تعارف کرائے گا۔
additives جو ثانوی ساخت کو کم کرتے ہیں۔
سلفوکسائیڈ(DMSO)
جین کے نمونےاعلی GC مواد کے ساتھتاہم، DMSO Taq پولیمریز کی سرگرمی کو بھی بہت کم کرتا ہے۔لہذا، ہر ایک کو ٹیمپلیٹ کی رسائی اور پولیمریز کی سرگرمی میں توازن رکھنا ہوگا۔ایڈیٹر تجویز کرتا ہے کہ آپ اپنے تجربے کے مطابق ارتکاز تلاش کرنے کے لیے DSMO کے مختلف ارتکاز کو آزما سکتے ہیں، جیسے کہ 2% سے 10% تک۔
غیر آئنک ڈٹرجنٹ
غیر آئنک ڈٹرجنٹ، جیسے 0.1-1% Triton X-100، Tween 20 یا NP-40، عام طور پر DNA کی ثانوی ساخت کو کم کرتے ہیں۔اگرچہ یہ ٹیمپلیٹ جین کی افزائش کو بڑھا سکتا ہے، لیکن یہ غیر مخصوص امپلیفیکیشن کی پریشانی کا سبب بھی بنے گا۔لہذا، یہ اضافی چیزیں ملبے کے بغیر کم پیداوار والے پی سی آر رد عمل کے لیے اچھی طرح کام کرتی ہیں، لیکن نسبتاً ناپاک PRC رد عمل کے لیے اتنی اچھی نہیں۔غیر آئنک ڈٹرجنٹ کا ایک اور فائدہ SDS آلودگی میں کمی ہے۔عام طور پر ڈی این اے نکالنے کے عمل کے دوران، ایس ڈی ایس کو پی سی آر مرحلے پر لایا جائے گا، جو پولیمریز کی سرگرمی کو بہت زیادہ روکتا ہے۔لہذا، رد عمل میں 0.5% Tween-20 یا Tween-40 شامل کرنا SDS کے منفی اثرات کو بے اثر کر سکتا ہے۔
بیٹین_
Betaine ثانوی ساخت کی تشکیل کو کم کرکے ڈی این اے پروردن کو بہتر بنا سکتا ہے اور یہ عام طور پر کمرشل پی سی آر کٹس میں ایک "اسرار" اضافہ ہے۔اگر آپ betaine استعمال کرنا چاہتے ہیں، تو آپ کو betaine یا betaine mono-hydrate (Betaine یا Betaine mono-hydrate) ڈالنا چاہیے، لیکن betaine hydrochloride (Betaine HCl) نہیں، 1-1.7M کے حتمی ارتکاز میں ایڈجسٹ کریں۔Betaine مخصوصیت کو بہتر بنانے میں بھی مدد کر سکتا ہے کیونکہ یہ DNA پگھلنے/DNA denaturation کے بنیادی جوڑے کی ساخت کے انحصار کو ختم کرتا ہے۔
غیر مخصوص پرائمنگ کو کم کرنے کے لیے additives
فارمامائڈ
فارمامائڈ ایک عام طور پر استعمال شدہ نامیاتی پی سی آر اضافی ہے۔یہ ڈی این اے میں بڑے نالی اور معمولی نالی کے ساتھ مل سکتا ہے، اس طرح ماسٹر ڈی این اے ڈبل ہیلکس کے استحکام کو کم کرتا ہے اور ڈی این اے کے پگھلنے والے درجہ حرارت کو کم کرتا ہے۔PCR تجربات میں استعمال ہونے والے فارمامائڈ کا ارتکاز عام طور پر 1%-5% ہوتا ہے۔
ٹیٹرامیتھائلامونیم کلورائد( TMAC)
Tetramethylammonium chloride ہائبرڈائزیشن (hybridization specificity) کی خصوصیت کو بڑھا سکتا ہے اور DNA کے پگھلنے والے درجہ حرارت کو بڑھا سکتا ہے۔اس طرح، TMAC غیر مخصوص پرائمنگ کو ہٹا سکتا ہے اور DNA اور RNA کی غلط بائنڈنگ کو کم کر سکتا ہے۔اگر آپ استعمال کرتے ہیں۔ڈیجنریٹ پرائمرPCR ردعمل میں، TMAC شامل کرنا یاد رکھیں، جو عام طور پر 15-100mM کے ارتکاز میں استعمال ہوتا ہے۔
دیگر عام additives
مذکورہ بالا دو قسموں کے additives کے علاوہ، PCR کے رد عمل میں بہت سے عام additives ہیں، اگرچہ ان کے کام مختلف ہیں، لیکن وہ بہت اہم بھی ہیں۔
میگنیشیم آئن
میگنیشیم آئن پولیمریز کا ایک ناگزیر کوفیکٹر (کوفیکٹر) ہے، یعنی میگنیشیم آئن کے بغیر، پولیمریز غیر فعال ہے۔تاہم، بہت زیادہ میگنیشیم آئن پولیمریز کی کارکردگی کو بھی متاثر کر سکتے ہیں۔ہر پی سی آر ردعمل میں میگنیشیم آئنوں کا ارتکاز مختلف ہوگا۔چیلیٹنگ ایجنٹس (جیسے EDTA یا citrate)، dNTPs اور پروٹین کا ارتکاز سبھی میگنیشیم آئنوں کے ارتکاز کو متاثر کرتے ہیں۔لہذا، اگر آپ کو اپنے پی سی آر کے تجربے میں دشواری ہے، تو آپ مختلف میگنیشیم آئن ارتکاز کو تبدیل کرنے کی کوشش کر سکتے ہیں، مثال کے طور پر، 1.0 سے 4.0mM تک، درمیان میں 0.5–1mM کے وقفے کے ساتھ۔
یہ بات قابل غور ہے کہ ایک سے زیادہ منجمد پگھلنے کے چکر میگنیشیم کلورائد محلول کی ارتکاز کی سطح بندی کا باعث بن سکتے ہیں۔لہذا، آپ کو ہر استعمال سے پہلے اسے مکمل طور پر تحلیل کرنا چاہیے، اور اسے استعمال کرنے سے پہلے اچھی طرح مکس کر لیں۔
بوائین سیرم البومین(بووائن البومین، بی ایس اے)
مالیکیولر کیمسٹری کے تجربات میں، بوائین سیرم البومین ایک بہت عام اضافہ ہے، خاص طور پر پابندی والے انزائم ہضم اور PCR تجربات میں۔پی سی آر کے رد عمل میں، بی ایس اے فینولک مرکبات جیسے آلودگیوں کو کم کرنے میں مددگار ہے۔اور یہ بھی کہا جاتا ہے کہ یہ ٹیسٹ ٹیوب کی دیوار سے ری ایکٹنٹس کے چپکنے کو کم کر سکتا ہے۔پی سی آر کے رد عمل میں، عام طور پر شامل کردہ بی ایس اے کا ارتکاز 0.8 ملی گرام/ملی لیٹر تک پہنچ سکتا ہے۔
 
متعلقہ مصنوعات:
پی سی آر ہیرو(رنگ کے ساتھ)
پی سی آر ہیرو


پوسٹ ٹائم: فروری 10-2023