• فیس بک
  • لنکڈ
  • یوٹیوب

پی سی آر ریجنٹس کے ابتدائی مرحلے میں پرائمر اور پروبس کی کارکردگی کی تصدیق کرنا اور رد عمل کے موزوں ترین حالات کا تعین رسمی تجربات کی ہموار پیش رفت کو یقینی بنانے کے لیے ضروری ہیں۔

تو ہمیں ابتدائی مرحلے میں پرائمر پروب کی تصدیق کرنے کی ضرورت کیسے ہے؟

اہم اشارے بنیادی لائن، ایمپلیفیکیشن وکر، سی ٹی ویلیو، ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی، کم ارتکاز کے نمونے کا پتہ لگانا، سی وی وغیرہ ہیں۔

بیس لائن

بیس لائن پی سی آر ایمپلیفیکیشن وکر میں افقی لائن ہے۔پی سی آر ایمپلیفیکیشن ری ایکشن کے پہلے چند چکروں میں، فلوروسینس سگنل زیادہ تبدیل نہیں ہوتا اور ایک سیدھی لکیر بناتا ہے۔یہ سیدھی لائن بیس لائن ہے۔

پی سی آر پرائمر پروبس کی اسکریننگ کرتے وقت، اس بات پر توجہ دیں کہ آیا بیس لائن لیول ہے۔پرائمر پروب کے ارتکاز کی پاکیزگی بیس لائن کو متاثر کرے گی، جیسے کہ بیس لائن کا بڑھنا یا گرنا۔بیس لائن بھی ایک انتہائی بدیہی اشارے ہے۔
تجزیہ

ایمپلیفیکیشن وکر

ایک اور بدیہی اشارے امپلیفیکیشن وکر کی شکل ہے۔ثانوی امپلیفیکیشن یا دیگر غیر معمولی ایمپلیفیکیشن کروز سے بچنے کے لیے ایس کے سائز کا وکر رکھنا بہتر ہے۔
خالی

سی ٹی ویلیو

بیس لائن سے کفایتی نمو تک انفلیکشن پوائنٹ سے مطابقت رکھنے والے چکروں کی تعداد Ct قدر ہے۔

ایک ہی نمونے کے لیے، مختلف پرائمر پروبس کے نتیجے میں مختلف ایمپلیفیکیشن کروز نکلتے ہیں، اور متعلقہ Ct ویلیو ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی اور مداخلت کی ڈگری سے متاثر ہوگی۔اصولی طور پر، ہم پرائمر پروب کی Ct قدر جتنی چھوٹی ہوگی، اتنا ہی بہتر ہے۔

تجزیہ-3

امپلیفیکیشن کی کارکردگی

پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کو جانچنے کے لیے سب سے زیادہ قابل اعتماد اور مستحکم طریقوں میں سے ایک معیاری وکر ہے، جسے محققین بھی بڑے پیمانے پر تسلیم کرتے ہیں۔اس طریقہ کار میں ٹارگٹ ٹیمپلیٹس کی نسبتہ تعداد کو کنٹرول کرنے کے لیے نمونوں کی ایک سیریز بنانا شامل ہے۔یہ نمونے عام طور پر مرتکز اسٹاک سلوشنز کے سیریل ڈائلیشنز کے ذریعے بنائے جاتے ہیں، سب سے زیادہ استعمال ہونے والا 10 گنا کم کرنا ہے۔پتلے نمونوں کی ایک سیریز کا استعمال کرتے ہوئے، معیاری qPCR پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے Cq قدر حاصل کرنے کے لیے، اور آخر میں ہر نمونے کے ارتکاز اور متعلقہ Cq قدر کے مطابق ایک معیاری وکر کھینچیں تاکہ لکیری مساوات Cq= -klgX0+b، اور امپلیفیکیشن کی کارکردگی E=10(-1 /k1)-مقداری تجزیہ کے لیے کیو پی سی آر کا استعمال کرتے وقت، ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کا 90%-110% (3.6>k>3.1) کی حد میں ہونا ضروری ہے۔

تجزیہ-4

کم ارتکاز کے نمونوں کا پتہ لگانا

جب نمونے کا ارتکاز کم ہوتا ہے تو مختلف پرائمر پروبس کی کھوج کی شرحیں مختلف ہوتی ہیں۔ہم نقل کرنے کے لیے 20 کم ارتکاز کے نمونے منتخب کرتے ہیں، اور سب سے زیادہ پتہ لگانے کی شرح کے ساتھ پرائمر پروب سسٹم بہترین ہے۔

تجزیہ-5

تغیر کا عدد (CV)

نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن کا پتہ لگانے کے لیے ری ایجنٹ کے لائن اسٹینڈرڈ کے مطابق مختلف پرائمر پروبس کے ساتھ 10 ڈپلیکیٹ نمونوں کا پتہ لگایا جا سکتا ہے۔

تجزیہ-6

مقداری ری ایجنٹس:
درستگی
ایک بیچ کے اندر درستگی کو پورا کرنا چاہئے: ٹیسٹ کے ارتکاز کی لوگارتھمک قدر کے تغیر کا گتانک (CV,%) ≤5% ہے۔جب نمونے کا ارتکاز کم ہوتا ہے، تو پتہ لگانے کے ارتکاز کے لوگارتھم کے تغیر کا گتانک (CV,%) ہوتا ہے ≤10%


کوالیٹیٹو ری ایجنٹس:
درستگی
ایک بیچ کے اندر درستگی کو پورا کرنا چاہئے:

(1) Ct قدر کے تغیر کا گتانک (CV,%) ≤5%

ایک ہی نمونے کا متوازی طور پر 10 بار ٹیسٹ کیا جاتا ہے، اور ٹیسٹ کے نتائج ایک جیسے ہونے چاہئیں


پوسٹ ٹائم: ستمبر 18-2021